槲皮素抗菌活性的研究

槲皮素抗菌活性的研究
秦晓蓉;张铭金;高绪娜;林义;马利;何思宜
【摘要】以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等为实验菌株,采用药敏纸片法考察槲皮素的抗菌活性.槲皮素对金黄色葡萄球菌的抗菌效果最好,最低杀菌浓度小于0.0061 μmol·mL-1;对胶质芽孢杆菌抗菌效果次之,最低抑菌浓度小于0.0061 μmol·mL-1;对大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌也有较为明显的抗菌效果,最低抑菌浓度分别为0.0242 μmol·mL-1、0.0061 μmol·mL-1、0.0485
μmol·mL-1、0.0121 μmol·mL-1,最低杀菌浓度分别为1.5522 μmol·mL-1、6.2086 μmol·mL-1、3.1043 μmol·mL-1、1.5522 μmol·mL-1;对人仓白杆菌无抗菌效果.槲皮素具有广谱抗菌性,并且对革兰氏阴性菌的抗菌作用强于革兰氏阳性菌.
【期刊名称】《化学与生物工程》
【年(卷),期】2009(000)004
【总页数】4页(P55-57,78)
【关键词】槲皮素;最低抑菌浓度;最低杀菌浓度
【作者】秦晓蓉;张铭金;高绪娜;林义;马利;何思宜
【作者单位】武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北,武汉,430081;武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北,武汉,430081;中国科学院武汉物理与数学研究所,湖北,武汉,430071;武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北,武汉,430081;武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北,武汉,430081;武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北,武汉,430081;武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北,武汉,430081
【正文语种】中文
【中图分类】Q93
槲皮素(Quercetin, Que)，属黄酮类化合物，存在于许多植物的花、叶、果实中。

生物类黄酮亦称维生素P，常与维生素C伴存，属植物次级代谢产物，在植物界
中分布广泛，目前已有6000多种黄酮被鉴定[1]，可作为植物源杀菌剂。

植物源
杀菌剂因不易引起耐药性[2]而倍受关注，目前植物源杀菌剂的研究主要集中在植
物提取物抑菌效果方面，如对洋葱、黄柏、风车藤属等植物提取物的抗菌活性研究[3～5]。

植物提取物为混合物，具有抗菌活性的可能只是其中一种或几种化合物。

作者在此以大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和人仓白杆菌为实验菌株，对槲皮素的抗菌活性进行研究。

1 实验
1.1 仪器与材料
HZ200LB型恒温摇床，WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计，SPX-250B-Z型
生化培养箱。

蛋白胨、牛肉浸膏，北京双旋微生物培养基制品厂；槲皮素，陕西生化药业有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

实验菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、胶
质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、人仓白杆菌(Ochrobactrum anthropi)，均由武汉科技大学生物工程实验室提供。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2 药敏片的制备
将新华定性滤纸裁成6 mm的小圆片，分装于洁净干燥的试管内，100℃干热灭菌2 h；在无菌条件下将灭菌滤纸片浸于倍比稀释的槲皮素溶液[二甲基亚砜(DMSO)作溶剂]中，4℃下静置4 h，保存备用。

1.3 菌株培养
将斜面菌种在牛肉膏蛋白胨培养基上活化培养2次，然后取1环接种到20 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃、180 r·min- 1振荡培养24 h，测定菌液在600 nm的吸光度，根据微生物浑浊度计数法确定细菌的个数。

1.4 抗菌实验
无菌条件下将高压灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基20 mL趁热倒入无菌培养皿内，待其冷却凝固后用移液枪移取0.5 mL活化后的菌液(含菌数约1×109 CFU·mL-1)涂布于平板上。

将含槲皮素溶液的药敏片贴在含菌平板上，每皿贴3片，每菌作3次重复。

将只涂布菌液的平板作为空白对照1、贴有溶剂DMSO滤纸片的含菌平板作为空白对照2、贴有槲皮素药敏片的无菌平板作为空白对照3。

将上述平板倒置放入30℃培养箱培养12 h。

1.5 抗菌效果的测试
抑菌效果的测试：以空白对照1(细菌正常生长)为参照，观察不同浓度药敏片周围细菌生长情况。

用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，重复3次，取平均值。

抑菌圈越大，抑菌效果越好；如果不产生抑菌圈，则说明此浓度无抑菌效果。

以产生抑菌圈的最小槲皮素浓度为最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration, MIC)。

杀菌效果的测试：观察药敏片周围细菌生长情况，测量滤纸片周围形成的杀菌圈直径，重复3次，取平均值。

以无菌生长或只生长5个菌落以下的最小槲皮素浓度为最低杀菌浓度(Minimal bactericidal concentration, MBC)。

2 结果与讨论
2.1 槲皮素的抑菌效果和杀菌效果
接种菌液初始浓度分别为：大肠杆菌2.1×109 CFU·mL-1、苏云金芽孢杆菌
4.2×109 CFU·mL-1、枯草芽孢杆菌3.6×109 CFU·mL-1、胶质芽孢杆菌
3.2×109 CFU·mL-1、铜绿假单胞菌3.5×109 CFU·mL-1、人仓白杆菌3.5×109 CFU·mL-1、金黄色葡萄球菌
4.4×109 CFU·mL-1。

在菌液接种量为0.5 mL、培养基pH值为7.0、生化培养箱温度为30℃的条件下，考察了Que倍比稀释的系列浓度(0.0061～397.3510 μmol·mL-1 )对以上7种菌的抗菌效果。

结果表明，菌液初始浓度并不影响抗菌效果。

金黄色葡萄球菌初始浓度最大，Que对其抗菌作用并未因此而弱于其它菌株；Que对人仓白杆菌无抗菌
效果，因为人仓白杆菌敏感度低，某些抗生素对其无作用[6]；Que对金黄色葡萄
球菌的抗菌效果最好，当Que浓度为0.0061 μmol·mL-1时，对金黄色葡萄球菌已有杀灭作用。

Que对实验菌株的抑菌效果见图1(为了直观地表达抑菌圈直径变化较大时所对应
的Que浓度范围，图中只取了Que浓度小于3.1043 μmol·mL-1的部分)。

图1 槲皮素的抑菌效果Fig.1 The inhibitory effect of quercetin
图1表明，Que浓度大于0.3880 μmol·mL-1时，随着Que浓度的增加，抑菌圈直径的变化较小。

Que对胶质芽孢杆菌的抑菌圈直径范围为8.16～13.18 mm。

Que浓度为0.0061 μmol·mL-1时，抑菌圈直径就达8.16 mm；随Que浓度增加，抑菌圈直径缓慢
增加，抑菌效果非常明显。

表明胶质芽孢杆菌对Que的敏感度较高。

Que对大肠杆菌的抑菌圈直径范围为6.42～14.98 mm。

Que浓度为0.0061～0.0121 μmol·mL-1时，Que对大肠杆菌无抑制效果；Que浓度为0.0970～
0.1940 μmol·mL-1时，随Que浓度增加，抑菌圈直径急剧增大，抑菌效果增加
明显。

Que对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径范围为6.32～13.98 mm。

随Que浓度增加，
抑菌圈直径急剧增大，抑菌效果增加明显。

Que对苏云金芽孢杆菌的抑菌圈直径范围为6.88～12.74 mm。

Que浓度为0.0061～0.0242 μmol·mL-1时，随Que浓度增加，抑菌圈直径急剧增大，抑菌效果增加明显。

Que对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径范围为6.32～12.60 mm。

Que浓度为
0.0061～0.0485 μmol·mL-1时，Que对枯草芽孢杆菌的抑菌效果较弱，抑菌圈直径小于6.5 mm；Que浓度为0.0485～0.3880 μmol·mL-1时，抑菌圈直径急剧增大，抑菌效果明显。

Que对实验菌株的杀菌效果见图2。

图2 槲皮素的杀菌效果Fig.2 The bactericidal effect of quercetin
图2表明，Que对金黄色葡萄球菌的杀灭作用较强，Que浓度为0.0061
μmol·mL-1时，Que对金黄色葡萄球菌的杀菌圈直径已达9.00 mm；随着Que 浓度的增加，杀菌圈直径缓慢增加到12.26 mm。

Que浓度为1.5522 μmol·mL-1时，Que对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的杀菌圈直径分别为10.48 mm和9.52 mm；随着Que浓度的增加，杀菌圈直径分别增加到13.54 mm和12.90 mm。

Que浓度为3.1043 μmol·mL-1时，Que对枯草芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌的杀菌圈直径分别为9.88 mm和8.98 mm；随着Que浓度的增加，杀菌圈直径分别增加到13.88 mm和13.18 mm。

Que对苏云金芽孢杆菌的杀灭作用较弱，Que浓度为6.2086 μmol·mL-1时，Que对苏云金芽孢杆菌的杀菌圈直径为9.40 mm；随着Que浓度的增加，杀菌圈直径增加到12.58 mm。

2.2 槲皮素对实验菌株的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度
Que对实验菌株的MIC和MBC见表1。

表1 槲皮素的MIC和MBC/μmol·mL-1Tab.1 The MIC and MBC of
quercetin/μmol·mL-1实验菌株MICMBC大肠杆菌0 02421 5522苏云金芽孢
杆菌0 00616 2086金黄色葡萄球菌<0 0061<0 0061枯草芽孢杆菌0 04853 1043胶质芽孢杆菌<0 00613 1043铜绿假单胞菌0 01211 5522人仓白杆菌无明显效果无明显效果
由表1可看出，Que对金黄色葡萄球菌和胶质芽孢杆菌的抑菌作用较强，其MIC
小于0.0061 μmol·mL-1。

Que浓度为0.0061 μmol·mL-1时，对胶质芽孢杆菌
的抗菌效果非常明显，抑菌圈直径达8.16 mm，而对金黄色葡萄球菌已具有杀灭
作用。

Que对苏云金芽孢杆菌﹑铜绿假单胞菌、大肠杆菌的MIC分别为0.0061
μmol·mL-1、0.0121 μmol·mL-1、0.0242 μmol·mL-1，抑菌效果也较为明显。

Que对枯草芽孢杆菌抑菌效果稍差，MIC为0.0485 μmol·mL-1，抑菌圈也很明显。

而Que对人仓白杆菌无明显抑菌效果。

由表1还可看出，Que对高敏感金黄色葡萄球菌的MBC小于0.0061 μmol·mL-1。

Que对大肠杆菌、铜绿假单胞菌的MBC均为1.5522 μmol·mL-1。

Que对枯草芽孢杆菌﹑胶质芽孢杆菌的MBC均为3.1043 μmol·mL-1。

而Que对苏云金
芽孢杆菌的MBC较高为6.2086 μmol·mL-1。

Que对人仓白杆菌无明显杀菌效果。

2.3 讨论
2.3.1 槲皮素对球菌和杆菌的抗菌效果
实验菌株只有金黄色葡萄球菌为球菌，杆菌有大肠杆菌、铜绿假单胞菌等。

杆菌大小都在(0.3～2.2 μm)×(1.0～3.0 μm)之间。

从实验结果可以看出，Que对金黄色葡萄球菌的抗菌效果要明显优于其对杆菌的效果。

Que的浓度为0.0061
μmol·mL-1时，就对金黄色葡萄球菌有明显的杀菌作用，杀菌圈直径达9.00 mm；而杆菌在Que浓度达1.5522 μmol·mL-1之前只出现了抑菌圈。

其原因可能与细菌结构有关，球菌形态更利于其在培养基表面紧密排布。

2.3.2 槲皮素对革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)的抗菌效果
大肠杆菌、胶质芽孢杆菌、铜绿假单胞菌属G-细菌，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌属G+细菌。

排除金黄色葡萄球菌结构的影响，比较5种杆菌可知：胶质芽孢杆菌的MIC小于0.0061 μmol·mL-1，大肠杆菌和铜绿假单胞菌的MBC为1.5522 μmol·mL-1，而枯草芽孢杆菌的MBC为3.1043 μmol·mL-1，苏云金芽孢杆菌的MBC为6.2086 μmol·mL-1。

说明Que对G-杆菌的抗菌效果更好，G-杆菌对Que的敏感度较高。

这可能是由于G-细菌细胞壁较薄，Que对其抗菌效果更明显。

3 结论
以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等为实验菌株，采用药敏纸片法考察槲皮素的抗菌活性。

结果表明，槲皮素对金黄色葡萄球菌的抗菌效果最好，最低杀菌浓度小于0.0061 μmol·mL-1；对胶质芽孢杆菌抗菌效果次之，最低抑菌浓度小于0.0061 μmol·mL-1；对大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌也有较为明显的抗菌效果；对人仓白杆菌无抗菌效果。

槲皮素具有广谱抗菌性，并且对革兰氏阴性菌的抗菌作用强于革兰氏阳性菌。

参考文献：
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