实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切片）

实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切
片）
免疫组化的原理说起来其实挺简单的，抗原抗体反应嘛，通过采用显色剂来标记抗体，进行化学反应后便能显色，从而确定出组织细胞中的抗原。

可以进行定位、定性以及定量。

石蜡切片或者冰冻切片均可以做免疫组化的实验，前期的过程会有所不同：
石蜡切片：取出需要实验的石蜡切片，先进行脱蜡处理，最后置于自来水中备用。

对于冰冻切片，无需上述步骤，直接从-20℃冰箱中取出即可进行后续的操作啦~~~
接下来的步骤就全部一样啦~~~
抗原修复：由于我们在制备石蜡切片或者冰冻切片时，采用福尔马林进行固定，会使得组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛建，使得不少抗原决定簇被封闭；采用多聚甲醛会具有聚合作用，均阻碍了抗原和抗体的结合。

所以我们怎么着都要进行这步哒，虽然比较耗时。

言归正传，具体的抗原修复液为：
0.51 g 柠檬酸钠
0.095 g 柠檬酸
双蒸水定容至250 mL
偷偷告诉你可以偷懒的，配置为10×抗原修复液后，每次实验稀释后使用就可以了。

配置好修复液后，将切片置于其中，采用微波修复法修复（中火，
5 min），取出后冷却至室温（一般放在4℃冰箱冷却更快），再进行如上微波修复后冷却，一共三次。

阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢（30%过氧化氢，采用甲醇稀释10倍即可得到）中10 min即可。

随后采用1×PBS洗三次，每次5 min。

抗原抗体反应步骤：这部分内容就会因使用的试剂盒的不同而略有差异了，我使用的是中杉金桥的二步法试剂盒，过程比较简单，接上一步骤后直接加一抗（1×PBS稀释）4℃孵育过夜。

第二天洗一抗（1×PBS洗三次，每次5 min）后加二抗室温孵育半小时后，同上洗三次。

Tips: 有些试剂盒会需要先用血清封闭后再加一抗孵育的。

还有哦，孵育要在湿盒中哦，不然全挥发咯会。

DAB显色：这步挺关键的，显色的时间把握很重要，显色过度会颜色太深而观察不到有效的结果，时间过短也会显色不完全。

建议采用计时器精确计时，并保证各组显色时间一致。

很多实验结果不好跟这步没把握好有很大的关系。

显色完成后采用自来水终止即可复染：苏木素复染，并采用盐酸酒精分化。

采用逐步脱水的方式脱水，树脂封片。

Tips: 逐步脱水顺序80%乙醇----95%--95%--100%中各30 s左右，最后置于二甲苯中15 min以上后即可封片。

小贴士
方法步骤看似是不难的，但是结果往往差强人意。

一步一步分析，经常会在多个环节发生问题，比如：一抗比例不够？组织样本的来源和你的试剂盒的匹配度不对？只做人源性样本的试剂盒拿来做了小鼠的。

显色时间摸索不够，有些可能需要10分钟显示，而你做了5
分钟就放弃了；中间的某个步骤忘记了？等等，这些都是容易犯错的地方，说到底还是老生常谈，仔细仔细仔细，用脑子用脑子用脑子。

上面为大家介绍了免疫组化的基本操作步骤，小伙伴们实验下来感觉怎么样呢？如果有遇到问题，那接下来的这些小总结或许对你有所帮助哦~~~~这些都是根据小编自己做试验遇到的一些问题总结出来的经验，不全面之处烦请大家批评指正~
1、冰冻切片和石蜡切片如何取材？
冰冻切片取材分为两种情况：
1）动物灌流固定：（也是小编经常取材的方式）如小鼠心脏灌流，首先采用预冷的1×PBS灌流冲洗直至血液全部放出，随后灌注4%PFA直至小鼠僵直，之后解剖得到组织，于4℃、4%PFA中固定1 h左右，1×PBS洗5次，每次30 min，25%蔗糖溶液脱水12 h左右后包埋即可。

脱水这一步很重要的，
2）直接取材：直接选择新鲜组织进行冰冻切片。

此类冰冻切片在进行免疫组化时不需要进行抗原修复。

其实我个人不建议直接切片，因为切出的片子含水量会比较多，形成冰晶影响结果，而且后期的丙酮固定也会改变细胞的形态。

石蜡切片取材：动物组织取材（灌流与否都可以，并不影响后续的操作）后，置于10%福尔马林溶液中固定3-4天后，脱水，包埋，即可进行石蜡切片操作。

2、石蜡切片和冰冻切片的区别比较
石蜡切片制备过程相对较复杂，抗原活性丢失较多，但切片较薄，
3-5 μm，便于观察细胞的细微结构，而且常温保存即可，非常方便；冰冻切片较厚，8-12 μm，操作较简单，能够较完好的保存多种抗原活性，但保存的时间相对较短，也有人说做出来的片子没有石蜡做出来的好看，这一点我不晓得，不过我个人是比较偏爱冰冻切片的。

3、一抗的选择？抗体孵育的条件？
一抗的比例问题，也会极大的影响到实验的结果，一般来说根据抗体说明书或者western blot的抗体比例来做基本问题不大，个别也会需要在此基础上加大抗体浓度。

这跟western blot抗体浓度的摸索是一样的道理；至于孵育的条件，对于组织样本，一般需要在4℃冰箱孵育过夜，并保持湿盒里面的湿度防止抗体蒸发。

对于难以着色的，在第二天还需将湿盒置于室温孵育（时间需要自己摸索，目的都是促进抗原抗体的结合）。

4、DAB显色时间的把握？
DAB显色的时间并非固定，需要自己摸索，怎么摸索？我个人的经验是先选择一张阳性的片子，采用计时器精确计时，在显微镜下判断出具体时间后，再对所有的片子进行显色，采用同样的时间来界定。

一般如果抗体浓度适宜，操作无误，10分钟内肯定能够显色，如果超过该时间，说明一抗比例不够或者封闭太久等等原因。

5、如何降低组织非特异性染色？
一抗的比例和选择非常重要，采用单克隆抗体能够极大的降低非特异性染色；一抗二抗的孵育时间也不能太久；1×PBS洗的次数和时间可以适当调整；DAB显色时间不宜过长，10-15 min以内。

6、复染时间的选择？盐酸酒精分化的时间判断？
苏木素复染的时间一般5 min左右，可以调整，如果染色太浅时间延长，反之缩短时间；随后进行盐酸酒精分化，数秒即可，自来水洗，最后置于氨水中返蓝。

7、片子容易脱片？
冰冻切片：一般小编会购买防脱玻片（表面涂有多聚赖氨酸）；组织在冰冻切片后需要置于室温中挥干40-60 min，再低温储存；操作过程中注意要保持片子湿润，滴加一抗或者1×PBS时不要用力过猛，尽量不要直接冲在组织上。

石蜡切片：石蜡烤片没烤好，也会容易出现脱片问题，其他的问题也跟冰冻切片一样需要注意。

8、染色背景的问题？
有时候会遇到染色背景较深或者一片棕色的情况，可能的原因有以下几种：
1）DAB显色时间太长，如上所说时间把握要在15 min内为宜，太长就会使得背景一片棕色无法区分；
2）抗体浓度过高以及孵育时间过长也是常见的原因；
3）其他就是一些基本的操作要把握好。