实时荧光定量PCR技术的原理及应用RealtimeQuantitative
实时定量PCR
实时定量PCR概述张璐（武汉轻工大学动物科学与营养工程学院）摘要:实时定量PCR(Real-time Quantitative PolymeraseChainReaction，RQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。
该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点，是对原有PCR技术的革新，扩大了PCR的应用范围。
本文综述了RQ-PCR技术的概念、分类、原理、应用及研究进展。
关键词：实时定量PCR、分类、应用1、实时定量PCR的基本概念及原理介绍1. 1实时定量PCR概念实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. 2涉及的几个术语简介1. 2. 1 荧光域值(threshold)的设定。
PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的l0倍。
1. 2. 2 Ct值它是指PCR扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。
初始量越多其到达指数扩增期的ct值越小。
定量结果虽然不能直接用ct值的大小表示，但可根据不同的公式计算后用于定量结果的表示。
1. 2. 3 扩增效率(E) 当扩增效率最大(E=1)且目的基因与参照物的扩增效率近似相同时实验结果才科学、可信。
因为E值5％的差异就可在26个循环后导致产物2倍的差别[1]，且不同的定量方法对E值要求也不同。
1. 2. 4溶解曲线，即Ct值与起始模板的关系。
研究表明，每个模板的D值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Q值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表D值。
因此。
只要获得未知样品的D值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR的原理及应用
实时荧光定量PCR的原理及应用导读实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光集团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。
其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。
(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。
Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。
实时荧光定量PCR技术的基本原理在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。
仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。
并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。
一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。
通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR技术的应用1. 基因工程研究领域①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA 水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系 模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl
荧光染料
SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 — — Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数（如图所示）。
实时荧光定量PCR(qPCR)技术简介
实时荧光定量 PCR 技术简介实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一项以PCR 反应为基础的DNA定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因的定性和定量分析。
现有两种常用的方法对PCR 产物进行荧光定量：一种是利用荧光染料与双链DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA探针对目标基因进行定量。
一、利用荧光染料进行定量一种最为常用的定量方法就是在PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所有的双链DNA 结合，并产生荧光。
游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链DNA结合的荧光分子才会释放荧光，随着DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。
利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。
然而，常用的诸如SYBR Green 染料会与所有的双链DNA 无差别地结合，包括引物二聚体，因此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。
二、利用荧光探针进行定量荧光探针只能检测出与自身序列互补的DNA 片段，因此用探针法定量可以有效地避免引物二聚体的干扰，使定量结果更加精确。
此外，通过使用携带不同荧光信号的多种探针，我们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。
荧光探针的5’端携带有一个荧光报告基团，3’端则为淬灭基团，在正常情况下两个基团间的距离很近，淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。
在PCR 反应过程中，引物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合；在延伸阶段，Taq 酶因为具有5’-3’核酸外切酶活性，会将探针，使得报告基团和淬灭基团相互分开，从而释放出荧光。
每增加一条目的基因的拷贝，就会有一个探针被切开并释放荧光信号，因此随着PCR 反应的进行，荧光信号会逐渐增强。
使用探针进行荧光定量的优点就是精确度和灵敏度都要比荧光染料高，且可以做到同时对多个基因进行定量，但是相应的合成探针的成本也要比使用荧光染料高出许多。
QRT-PCR(荧光定量PCR)
实用文档
CT 值（ threshold value ）：每个反应管内的 荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称 为 CT 值。 研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越 小。反之亦然。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表 CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
• 评估基因表达水平等方面的工作,并在不需要构建和筛选 cDNA的前提下，完成对cDNA片段的克隆
实用量的飞跃，而 且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解 决PCR污染问题、自动化程度高等特点。 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光 化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产 物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经 过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们 就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从 而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如下图) 。
实用文档
荧光定量PCR化学原理
1、SYBR Green （荧光染料掺入法） 在PCR反应体系中， 加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料 分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。
2、TaqMan （探针法） PCR扩增时在加入一对引物的同时 加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端 分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完 整时，报告基 团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩 增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报 告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可 接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光 分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同 步。
QRT-PCR(荧光定量PCR)
加入体积 (μL)
2.5 2.5 4 -6 0.5 - 1 0.3 – 0.5 0.3 5 μL 补足 25 μL
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为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技 术中引入了几个重要的概念： 基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初 数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线， 这样的直线即是基线。 荧光阈值（threshold）：是在荧光扩增曲线上人 为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩 增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线 （背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。荧光域 值是PCR3—15个循环荧光信号标准差的10倍， 荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。
内参的选择：普通PCR内参的大小没有多大要求， 但real time一般选择300bp以下。
它的作用在于你提取的RNA逆转录成cDNA时， 加入的浓度可能会不一致，即使用分光广度计测其 浓度，也会有仪器误差，跑出的条带要进行灰度分 析。用目的基因的积分光密度比上内参的光密度就 是你这个基因实际表达的量。
评估基因表达水平理logo该技术不仅实现了pcr从定性到定量的飞跃而且与常规pcr相比它具有特异性更强有效解决pcr污染问题自动化程度高等特点
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实时定量PCR (real-time
quantitative PCR)
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1、SYBR Green 法
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2、SYBR Green 法的优缺点
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2、TaqMan探针法
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TaqMan作用机理
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TaqMan法优缺点
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注意事项
一、防止RNA酶污染 二、一定要做内参的。不作内参 的结果是不可信的。
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实时荧光定量pcr技术原理与应用
实时荧光定量pcr技术原理与应用
实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR）是一种可以快速、准确测量靶基因拷贝
数目的分子生物学技术。
它结合了传统的PCR技术与荧光探
针技术，利用荧光信号的强弱来反映目标基因的表达水平。
实时荧光定量PCR的原理是，首先通过PCR技术对目标基因
进行放大，然后在PCR反应过程中添加一种含有荧光探针的
试剂。
荧光探针通常由两个部分组成，一个是与目标基因特异性结合的引物，另一个是带有荧光染料与荧光信号猝灭基团的探针序列。
当荧光探针与目标基因的引物结合时，荧光信号被猝灭；当探针与目标基因的模板序列结合并被PCR酶依次截
断时，荧光信号被释放出来。
荧光信号的强弱正比于目标基因在PCR过程中的拷贝数目。
实时荧光定量PCR广泛用于基因表达分析、疾病诊断、基因
突变检测等领域。
通过该技术可以定量测量目标基因的表达水平，比较不同条件下基因表达的差异，研究基因调控机制。
此外，实时荧光定量PCR还可以应用于微生物检测，如检测细菌、病毒、真菌等的数量和变异情况。
这项技术具有快速、高灵敏度、高特异性、高重复性等优点，因此在生命科学研究和临床应用中得到广泛应用。
总之，实时荧光定量PCR技术通过结合PCR和荧光探针技术，可以实现对目标基因拷贝数目的快速、准确测量。
它在基因表达研究、疾病诊断和微生物检测等领域发挥着重要作用。
实时荧光定量聚合酶链反应技术
实时荧光定量聚合酶链反应技术实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是实时荧光PCR（real-time PCR）的一种。
实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入可以反映PCR扩增进程的荧光基团，并在PCR过程中实时监测荧光信号的变化。
实时荧光定量PCR技术则是将定量PCR的原理应用到实时荧光PCR，通过在实时荧光定量PCR的基础上引入已知浓度的参照基因，或者通过标准曲线来达到对目的基因初始浓度的定量，换句话说，实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团（如荧光染料、荧光基团标记的探针或引物），并在整个PCR进程中实时监测荧光信号的累积，最后通过参照基因或标准曲线对未知浓度的模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR是20世纪90年代初期快速发展起来的可对起始DNA模板浓度精确定量的PCR方法。
在实时荧光定量PCR技术的发展进程中，两个重要的发现起着关键的作用：①在20世纪90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；②此后，荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
随着实时荧光定量PCR技术方法的成熟与稳定，以及配套仪器的不断完善，实时荧光定量PCR已经走向临床，如应用于各种病原体的检测。
一、定量PCR的原理与类别定量PCR是指以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类和最后检测的信号的不同可分为至少4种类型：直接定量检测法、放射性核素标记定量检测法、酶标记定量检测法和实时荧光定量PCR法。
根据反应体系是否设有参照物及其是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为4种方法：（一）有限稀释法也叫倍比稀释法，其参照品的浓度是通过不断稀释直至靶基因不能再扩增为止，然后根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数。
实时荧光定量PCR的应用前景
实时荧光定量PCR的应用前景实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的高效、灵敏的分子生物学方法。
它通过在PCR反应过程中监测PCR产物的荧光信号来定量检测DNA或RNA的数量。
随着生物科学研究的不断深入和生物医学领域的发展，实时荧光定量PCR在基础研究、临床诊断和生物工程等领域都具有广阔的应用前景。
1. 基因表达研究实时荧光定量PCR可以准确地测定靶向基因在不同生物样本或不同处理条件下的表达水平。
通过构建合适的荧光探针或引物，可以快速、精准地检测并定量基因在细胞或组织中的表达水平。
这对于研究基因调控、信号传导通路以及疾病发生机制等具有重要意义。
2. 微生物检测实时荧光定量PCR可以在短时间内检测出微生物的存在和数量，具有高度的灵敏性和特异性。
在感染性疾病的诊断中，通过检测患者体液中病原微生物的核酸，可以快速准确地确定感染病原体，并指导临床用药。
此外，在食品安全领域，实时荧光定量PCR也被广泛用于检测食品中的致病微生物，确保食品安全。
3. 个体基因分型实时荧光定量PCR可以对个体基因进行高通量的快速分型。
通过引物设计和荧光标记，可以对多个位点的基因进行同步检测，从而迅速获取个体的基因型信息。
这对于基因相关疾病的研究、药物治疗反应性的评估以及遗传学研究都具有重要意义。
4. 微量核酸检测实时荧光定量PCR对于微量核酸的定量也具有高灵敏度。
在复杂样本中，如稀释的血液样本、环境水样或古老的DNA，实时荧光定量PCR能够快速、准确地检测到微量的核酸。
这对于犯罪学、考古学以及环境监测等领域具有重要意义。
5. 肿瘤研究实时荧光定量PCR在肿瘤相关研究中发挥了重要作用。
可以通过监测癌基因、肿瘤抑制基因的表达水平，评估肿瘤的恶性程度和预后，为肿瘤的个体化治疗提供依据。
另外，实时荧光定量PCR还可用于检测循环肿瘤标志物等肿瘤相关指标，辅助肿瘤的早期诊断和疾病监测。
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于精确测量DNA 或RNA样本中特定目标序列数量的分子生物学技术。
该方法结合了传统PCR 技术和荧光探针技术，可以在PCR反应过程中实时监测和定量特定目标序列的扩增量。
实时荧光定量PCR的步骤如下：
1. 准备反应体系：包括特定目标序列的引物和荧光探针、PCR反应缓冲液、酶和DNA模板。
2. PCR反应：将反应体系放入实时荧光定量PCR仪中进行扩增反应。
PCR过程中，引物与DNA模板结合，酶进行DNA合成，目标序列得到扩增。
3. 荧光探针监测：在PCR反应中，荧光探针与目标序列结合，产生荧光信号。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的强度。
4. 数据分析：实时荧光定量PCR仪会根据荧光信号的强度，通过计算机算法来计算目标序列的起始数量。
可以利用标准曲线法或相对定量法进行数据分析，得到目标序列的绝对或相对数量。
实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、高准确性和广泛线性范围等优点，
广泛应用于分子生物学、医学诊断、基因表达分析等领域。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtim
(Real time Quantitative PCR)
分子生物学技术平台
江燕琼
精选ppt课件
1
提纲：
实时荧光定量PCR原理
数学原理
化学原理
实时荧光定量PCR的方法应用
绝对定量
相对定量
定量PCR的实验要素
平台定量PCR仪器介绍
精选ppt课件
2
实时荧光定量PCR定义：
药物疗效考核
耐药性研究
精选ppt课件
22
绝对定量与相对定量的定义
精选ppt课件
23
绝对定量通过标准品定量
绝对定量的标准样品：
已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。
标准样品的种类：
•含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒
•含有和待测样品相同扩增片段的cDNA
•PCR的产物
精选ppt课件
对照样品内参基因浓度
精选ppt课件
29
定量PCR的实验要素
精选ppt课件
30
样品
●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 ~ 2.0之
间
●DNA用量：0.05 ng –100 ng
●RNA纯度：OD260/OD280=2.0
●cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA
取1 uL
TaqMan法优缺点
精选ppt课件
20
Real-time PCR 方法应用
精选ppt课件
21
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测
转基因食品检测
基因表达研究
•相对定量(Relative Quantification，RQ)
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
15
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
16
RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
1
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
2
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
21
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
22
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
23
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
三、应用
用于核酸的定量如RNA、DNA的定量
用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，
RNA变异分析，溶解曲线分析等。
四、定量方法
1.
标准曲线法的绝对定量 标准曲线法的相对定量
比较CT法的相对定量
2.
3.
五、荧光材料
荧光探针和荧光染料
◇
SYBR green I ◇ 水解探针TaqMan ◇ 分子信标 ◇ 杂交探针
二、优越性
特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与 传统的PCR相比，特异性大为提高。 敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml，对数期分 析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中 病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量 较为准确，标本不需稀释。 重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数 扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用， CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更 稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。 自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。
荧光定量PCR技术 原理与结果 分析
罗喜鹏
一、含义
二、优越性 三、应用 四、定量方法 五、荧光材料 六、结果分析
一、含义
实时荧光定量PCR技术(Real-Time
Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。
光域值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差 的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
q-pcr的实验原理
q-pcr的实验原理宝子们，今天咱们来唠唠q - PCR这个超酷的实验技术的原理呀。
q - PCR呢，全称是实时荧光定量聚合酶链反应（Real - time Quantitative Polymerase Chain Reaction）。
这名字听起来是不是有点唬人？其实呀，没那么复杂啦。
咱们先从PCR说起吧。
PCR就像是一个超级复印机，它能把我们想要研究的一小段DNA给大量复制出来。
你想啊，DNA在细胞里的量有时候少得可怜，就那么一丁点儿，想要研究它可不容易呢。
PCR就解决了这个问题。
它有几个关键的小伙伴，一个是模板DNA，这就是我们要复制的那个原始蓝本啦。
还有引物，引物就像是导航小助手，告诉这个复印机从哪里开始复制，从哪里结束。
另外呢，还有DNA聚合酶，这个酶就像是勤劳的小工匠，按照模板的样子，一个一个地把新的DNA链给搭建起来。
还有那些原料，也就是dNTP啦，就像是盖房子用的小砖块。
那q - PCR比普通的PCR厉害在哪里呢？它的关键就在于这个“q”，也就是实时定量。
在q - PCR的反应体系里，有一些很神奇的荧光染料或者荧光标记的探针。
这些荧光的东西就像是小侦探一样，紧紧盯着反应的进程。
比如说有一种荧光染料叫SYBR Green，这个小染料可机灵了。
它平时呢，在溶液里没什么特别的，但是一旦DNA开始复制，新合成的双链DNA就像是它的小窝一样，它就会一下子钻进去，然后就发出荧光啦。
随着反应的进行，DNA越来越多，被染料结合的双链DNA也越来越多，荧光就越来越强。
还有一种是用探针的方法哦。
这个探针就像是一个带了信号发射器的小夹子。
它的一头和我们要检测的DNA序列特异性地结合，中间有个荧光基团，另一头有个猝灭基团。
在没有反应的时候，这个荧光基团发的光被猝灭基团给“憋住”了，就不发光。
但是一旦DNA开始复制，这个探针就会被DNA聚合酶给“剪开”，荧光基团就自由啦，就开始发出荧光。
通过检测这些荧光的强度，我们就能知道反应进行到什么程度啦。