XB209单纯疱疹病毒实验室检测讲解

单纯疱疹病毒实验室检测
单纯疱疹病毒是引起生殖器溃疡的主要病原之一。

HSV包括HSVI型和HSV2型，多数生殖器疱疹有HSV2型引起。

生殖器疱呈慢性复发过程，原发感染常表现为潜伏状态，尽管临床可以根据典型的水泡诊断生殖器疱疹，但三分之二的感染表现为无症状，且潜伏期排毒。

实验室诊断对于无症状感染具有重要意义，不仅防止性传播，而且防止母婴传播。

细胞学检查
[原理]
IISV感染宿主细胞可形成多核巨细胞，细胞经涂片染色，通过检查多巨细胞病变帮助诊断。

[材料]姖姆萨染液
巴氏染液
[方法]
1.标本采集：
①疱液：用结核菌素注射器和25针头，穿刺水疱抽取疱液，转入病毒运输液中，或用针头刺破水疱后棉拭子吸取疱液。

②溃疡：用棉拭子抹去溃疡表面的痂皮或污物，再用干净拭子用力擦拭溃疡基底部，充分沾取组织液或渗出液。

③宫颈：见淋球菌取材。

2.将标本涂片，室温干燥数分钟。

3.染色
①皮肤黏膜标本用甲不相酵固定5-10分钟，用姖姆萨染液染30分钟，待干、镜检。

②宫颈标本用95%乙酵固定15-60分钟，用巴氏溧色（见HPV染色），镜检。

[结果]
感染细胞呈胞浆空泡变，感染细胞相互融合成多核巨细胞，有时见核内包涵体。

[注意事项]
HSV感染细胞在水疱或溃疡基底处，尽可能取水疱标本。

[临床意义]
查到多核巨细胞或包涵体可作辅助性诊断。

但其敏感性较培养法低。

HSV细胞培养
[原理]
HSV在体外感染细胞，引起细胞病变，通过观察细胞病变初步判断病毒的进一步结合免疫学方法鉴定。

[材料]
1.Vero、Hela和BHK细胞等
2.标本运输培养基（配制见附录I）。

3.HSV生长培养基（配见附录I）。

4.HSV维持培养基（配见附录I）。

6.HSV荧光单克隆抗体试剂。

[方法]
2.标本采集：
①疱液：用结核菌素注射器和25针头，穿刺水疱抽取疱液，转入病毒运输液中，或用针头刺破水疱后，用棉拭子充分沾取疱液，洗入运输液中。

②溃疡：用棉拭子去除溃疡表面的痂皮或污物，再用干净拭子用力擦拭溃疡基底部，充分沾取组织液或渗出液，将标本洗入运输液中。

③宫颈：见淋球菌取材。

标本置于运送培养基中，24小时接种，超过24小时应置于低温冰箱保存。

2.细胞复苏和传代：冻存细胞管于37℃速溶
内容物
内容物移至细胞生长培养基中
37℃5%CO2环境下培养8小时
更换生长培养基，再培养2-5天细胞成片
倒去培养液
加入5ml胰酶-EDTA洗涤
倒去洗涤液
加入5ml胰酶-EDTA液
培养瓶置于37℃，4分钟细胞脱落
转移至10ml生长培养基
加入10%DMSO
分装保存于超低温冰箱备用
3.单层细胞制备：
胰酶消化细胞混合液
计数
调整细胞数量为1X105/ml
分装24孔培养板，每孔0.5ml
37℃培养8小时
单层细胞
4.标本接种与感染细胞：
0.3-0.5ml标本
培养孔（1-2孔）
37℃，5%CO2下1-2小时
吸去标本液，换维持培养基。

37℃培养3-7日
每日观察[细胞病变（CPE）记录：
0为无CPE；1+为25%细胞CPE；2+为25-49%细胞CPE；3+为50-74%细胞CPE；4+为75%以上细胞CPE。

]
荧光单抗染色
5.染色镜检：
直接免疫荧光法：感染细胞涂片用甲醇固定10分钟，淋洗。

加荧光标记单抗隆抗体，37℃染色30分钟。

封片后镜检。

[结果]
感染细胞阳性可见苹果绿色荧光的包涵体。

[注意事项]
1.棉拭和木杆含有对病毒有影响的物质，应将标本洗脱到运输培养基后，弃去拭子。

2.使用阴道制剂的病人标本不宜作HSV培养。

3.如果细胞生长过密，包涵体染色迵暗，则应降低培养中的细胞浓度。

4.如发现细胞生长稀疏、条束化，不能成片或被染则应重开一瓶保存的细胞作培养。

5.不同病期的标本对培养阳性率影响较大。

应尽可能取疱液。

6.正确保存标本，24小时不能接种的标本应放-70℃保存。

[临床意义]
细胞培养是诊断和鉴定HSV的“金标准”方法。

敏感性特性均高。

斑丘疹、水疱、溃疡、结痂性皮损标本中，HSV培养阳性率分别为25%、94%、87%、70%和127%。

HSV抗原检测（ELISA法）
[原理]
将特异性HSV抗体（1、2型）包被在酶标反应孔上，加入含有HSV抗原的标本及酶标记抗HSV抗体共同体孵育，反应形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，在底物作用下产生颜色，颜色的深浅与抗原量成正比。

[材料]
1.标本运送保存液
2.阳性对照
3.阴性对照
4.酶结合物
5.洗液
6.放大剂A（底物A）
7.放大剂B（底物B）
8.终止液
[方法]
1.标本收集：用无菌棉拭或涤沦拭子取疱液、溃疡液、痂皮组织、宫颈拭子或其它部位标本置于1ml保存液的标本瓶中，即做或2-8℃可保存三天，-20℃可保存四周。

2.标本处理：取新鲜标本或解冻至窒温标本，用强力涡漩振荡器振荡1分钟提取抗原。

3.阳性对照用前窒温涡漩混匀1分钟，阴性对照用前窒温涡混匀15分钟.
4.操作方法如下表
待测标本阳性对照阴性对照
200 200 200 酶标抗体50 50 50 37℃孵育90分钟，洗涤4次，每次2分钟
底物A 100 100 100 底物B 100 100 100
37℃孵育30分钟
终止液50 50 50 肉眼观察或酶标仪比色测OD值（波长490nm）
[结果]
Cut-off值计算：Cut off=N+0.15
N=3孔阴性OD值之平均值
每孔OD值要符合要求
阳性：OD＞Cut off+0.015。

示疱疹感染
阴性：OD＜Cut off+0.015。

示没有疱疹感染
可凝：OD=Cut off+0.015。

示不能确定，可考虑重做
[注意事项]
1.应尽量多取标本，疱液要刺破疱壁，用无菌棉签蕉取疱液，感染的溃疡面，要用棉签擦去脏物，再刮取溃疡基底组织液，宫颈标本应抹去宫颈口分泌物，再取宫项标本，或鬃宫颈溃疡物。

2.洗涤要充分。

洗涤过程注意防止交叉污染造成假阳性。

3.每盒试剂第一次要做阴阳性对照，确定Cut off值，阳性对照OD＞0.50，阴性对照OD＞0.30，每孔阴性值应在均值N±0.05范围，否则弃去。

[临床意义]
ELISA法由于方法简单、灵敏度和特异性高等优点，是目前HSV检测的常用方法。

HSV抗原阳性表示HSV现症感染，对症状不典型患者更具诊断意义。

免疫荧火法（分型）
[原理]
先将异硫氰酸萤光素（FTTC）与特异性抗HSV抗体结合，在一定条件下，再与标本中相应HSV抗原产生反应，形成抗原-荧光抗体复合物，通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光，即表示标本中存在相应的抗原。

[材料]
1.0.01mol/L的pH值7.2的PBS缓冲液。

2.荧光素标记的抗体。

[方法]
1.直接法
（1）标本取材后用丙酮或甲酵固定处理，标示标本区域。

(2)滴加标记荧光抗体于标本上，平置湿盒内，37℃温箱孵育30分钟取出。

（3）先用PBS缓冲液轻轻冲洗，然后连续通过三缸同样PBS浸泡，每次5分钟，并不时振摇，最后蒸馏水浸泡1-2分钟脱盐冷风待干，滴加缓冲甘油（分析纯甘油9份加0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液1份）封片。

（4）荧光显微镜检。

3.间接法
（1）待检标本涂片经固定后，滴加HSV抗体（一抗）放湿盒内，置37℃温箱孵育30分钟，用PBS缀冲液漂洗或浸泡三次，每次5分钟，并不时振摇，最后用蒸溜水洗一次，室温待干。

（2）滴加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二抗），放湿盒内置37℃温箱孵育30分钟，洗洗、封同片上。

（3）荧光显徽镜检。

[结果]
在荧光显徽镜下观察，果阳性时，上皮细胞或多核细胞内可见到苹果绿色荧光。

结果记录方法
3+～4+：强阳性，荧光闪亮且范围广泛。

2+：阳性，荧光明亮.
1+：弱阳性，荧光较弱，但清晰可见。

±：可疑，极弱可疑炎炎光。

-：阴性，无荧光。

[注意事项]
1.试验完毕,立即荧光镜检查，否则可暂放冰箱保存。

2.由于组织细胞中存在自然荧光，易出现非特异性果，每次试验均应设置已知阳性和阴性标本对照。

3.择特异性好，质量可靠的抗体，最好选用单抗。

[临床意义]
直接法方法简单，需时短，特异性高，但敏感性较差。

间接法敏感性高，一般比直接法高5～10倍，但方法较繁琐，需时较长。

免疫荧光试验阳性有助现症病人诊断，而且可以分型。

HSV抗体检测（ELISA法）
[原理]
将HSV特异性糖蛋白G（1.2型）作为抗原包被在微孔板条的反应孔上，加入
经处理血清在反应孔中孵育，如果标本阳性，特异性HSV（1.2型）IgM或IgG
与抗原结合，再加入酶标记抗入IgM或IgG抗体孵育形成复合物，然后加入酶底物显色，颜色的深浅与HSV抗体浓度成正比。

[材料]
1.薇孔板条：包被有抗原（HSV1.2）。

直接使用。

2.标准血清：人IgM、人IgG。

直接使用。

3.阳性对照血清：人IgM、人IgG。

直接使用。

4.阴性对照血清：人IgM、人IgG。

直接使用。

5.酶结合物：过氧化物酶标记的抗人IgM、IgG。

直接使用。

6.标本吸收缓冲液：检测IgM用，包含IgG/RF吸附剂[羊抗人IgG抗体]。

直
接使用。

标本稀释缓冲液：检测IgG用，直接使用。

7.清洗缓冲液：10倍浓缩。

8.底物液：直接使用。

9.终止液：直接使用。

[方法]
1.IgG血清稀释：10ul血清+1.0ml标本稀释缓冲液混匀（测I、II型IgG共用）。

IgG血清稀释：10ul血清+1.0ml标本稀释缓冲液混匀，室温吸收至少10分钟（测I、II型IgG共用）。

2.操作方法。

IgG（HSVI、II）检测按下表（单位：nl）
血清样本阳性对照阴性对照标准：C1C2
100 100 100 100 100 室温孵育30分钟，PBS洗涤4次，30秒/次
酶标抗体100 100 100 100 100 室温孵育30分钟，PBS洗涤4次，30秒/次
底物100 100 100 100 100
室温避光15分钟（19℃-23℃）
终止液100 100 100 100 100
酶标仪比色测定OD值，波长450nm
注：C1为高浓度（200RU/ml）；C2为中浓度（20RU/ml）
IgG（HSVI、II）检测按下表（单位：nl）
血清样本阳性对照
阴性对
照
标准： C
100 100 100 100
室温孵育30分钟，PBS洗涤4次，30秒/次
酶标抗体100 100 100 100
室温孵育30分钟，PBS洗涤4次，30秒/次
底物100 100 100 100
室温避光15分钟（19℃-23℃）
终止液100 100 100 100
酶标仪比色测OD值（30分钟内），波长450nm
3.计算：本法检测IgG为定量试验，根据C1和C2的OD值分别绘制标准典线，然后依样本OD值查标准线得到样本浓度。

检测IgM为半定量试验，根据样本OD 值与标准OD值比确定样本的阴性、阳性及阳性程度。

[结果]
IgG阳性：样本OD值/C2的OD≥1，查表报XXRU/ml（相对单位）。

IgG阴性：样本OD值/C2的OD＜1，报阴性。

IgG阳性：样本OD值/C的OD≥1，报阴性。

1＜比值＜2，报1+；比值2.0～5.0报2+；比值＞5.0报3+。

IgG阴性：样本OD值/C的OD＜1，报阴性。

[注意事项]
1.底物孵育时间与温度成反比，根据温度不同可作调整。

室温 14℃～18℃，孵育18分钟；室温 19℃～23℃，孵育15分钟；室温24℃～30℃，孵育12分钟。

2.IgM时要用吸收剂将样本的IgG吸收完全。

3.不能用吸附剂处理后的血清检测IgG型抗体。

4.检测IgM同时，使用吸收后样本进行IgG检测，可确认IgG/RF吸RF吸收效果，只有IgG检测阴性时，IgM检测结果才有效。

[临床意义]
1.HSV-IgG检测可用于证实既往HSV感染，主要用于回顾性诊断原发性感染，对恢复期或复发性HSV诊断意义不大。

只有当患者的急性期血清HSV-IgG阴性或抗体滴度低，而恢复期（疾病发怍后10～14天）血清抗体滴度增加4倍或4倍以上时，才有诊断意义。

HSV-IgG检测可用于亚临床无症状HSV感染者的诊断。