土茯苓大孔树脂不同洗脱部位的体外抗氧化活性研究

土茯苓大孔树脂不同洗脱部位的体外抗氧化活性研究
黄河;蒋剑平;陈芝芸;王德军;沈雅婷
【摘要】[目的]研究土茯苓不同大孔树脂洗脱部位的体外抗氧化活性.[方法]土茯苓60％乙醇提取物上HPD-300型大孔树脂,分别用0、30％、50％、70％、90％的乙醇进行洗脱,得到5个不同洗脱部位(FSGA、FSGB、FSGC、FSGD、FSGE);采用紫外分光光度法测定各部位的总黄酮及总酚含量;采用清除1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基、还原能力及总抗氧化活性三个体外化学试验,比较不同部位的抗氧化作用差异.[结果]土茯苓不同洗脱部位(FSGA、FSGB、FSGC、FSGD、FSGE)的总黄酮含量分别为0.60％、99.89％、97.94％、18.21％、16.40％,总酚含量分别为16.09％、47.31％、47.42％、42.79％、32.52％;其清除DPPH自由基能力、还原能力和总的抗氧化活性均随总黄酮和总酚浓度的增加而上升;土茯苓5个洗脱部位均有一定的抗氧化能力,对体外自由基有较好的清除作用.[结论]总酚类物质(总黄酮)可能是土茯芩抗氧化活性的药效物质基础之一.
【期刊名称】《浙江中医药大学学报》
【年(卷),期】2014(038)005
【总页数】5页(P617-621)
【关键词】土茯苓;总黄酮;总酚;抗氧化活性
【作者】黄河;蒋剑平;陈芝芸;王德军;沈雅婷
【作者单位】温州医学院附属第二医院浙江,温州325027;浙江中医药大学附属第一医院;浙江中医药大学动物实验研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】R331
土茯苓为百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎。

性平，味甘淡，归肝胃脾经[1]。

土茯苓在抗动脉硬化、治疗冠心病等方面具一定效果[2]。

目前，
土茯苓的化学成分研究目前主要集中在黄酮类物质[3]。

心血管疾病的发生、发展
与体内活性氧对DNA、蛋白质等的损伤密切相关[4]，而土茯苓提取物能显著改善肾性高血压大鼠体内氧化应激状况[5]。

这提示土茯苓中存在较强的抗氧化物质，
然有关土茯苓抗氧化应激的相关物质基础研究，笔者至今未见文献报道。

为了阐明土茯苓的抗氧化作用及其相关物质基础，本课题组前期提取、分离、纯化了土茯苓多糖（纯度为82.67%），并证明了其多糖具有较强的总的抗氧化活性及还原力，是土茯苓体内改善氧化应激的药效物质基础之一[6]。

本文采用60%乙醇对土茯苓黄酮进行超声提取，提取物上HPD-300型大孔树脂，用不同浓度的乙醇（0、30%、50%、70%、90%）进行洗脱，测定各洗脱物的总黄酮和总酚含量，评价
土茯苓各洗脱部位体外抗氧化活性，深入探寻土茯苓体内调节氧化应激的药效物质基础，为后续研究提供实验依据。

1.1 材料与试剂土茯苓，杭州百草中药有限公司（批号20100501）；芦丁，中国药品生物制品检定所（批号100080-200709）；没食子酸化学对照品，中国药品生物制品检定所（批号110831-200803）；甲醇，天津四友精细化学品有限公司（一级色谱纯，批号091021）；DPPH，sigma公司（批号047-04091）；BHT，南京亿隆科技有限公司（批号20111128）；钼酸胺，天津市化学试剂四厂凯达化工厂（批号090108）；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器 TU-1901型紫外-可见分光光度计（北京普析通用公司）；JJ200型电子天平（常熟双杰测试仪器厂）；R203B型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）。

1.3 方法
1.3.1 样品处理根据文献方法[7]，制备土茯苓总黄酮提取物（Totalflavonoidsfrom Smilaxglabra, TFSG）。

取TFSG 1.7864g，混悬于20 mL 10%乙醇中，上HPD-300大孔树脂柱，分别用2倍柱体积的纯化水、30%、50%、70%、90%乙醇以1 mL/min的流速进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，45℃减压浓缩至干，称重，得到不同浓度的乙醇洗脱物，分别命名为FSGA、FSGB、FSGC、FSGD、FSGE。

1.3.2 样品溶液的配制各洗脱部位干粉用乙醇配制浓度分别为0.2，0.4，0.8，1.6，1.80，
2.0 mg·mL-1的样品溶液。

1.3.3 总黄酮的含量测定采用NaNO2-A1(NO3)3-NaOH分光光度法[8]测定土茯苓总黄酮含量。

在510 nm波长测定吸光度(A)。

以A为纵坐标，以芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线。

取1mL各样品的无水乙醇溶液（2.0mg·mL-1）置于离心管中，在510nm测定
各样品溶液的吸光度值，代入标准曲线，计算样品的总黄酮含量。

1.3.4 总酚含量的测定土茯苓中总酚的含量测定采用Folin-Ciocalteu reagent法[9]。

在760 nm测吸光度（A）。

以A为纵坐标，以没食子酸含量(mg)为横坐标，绘制标准曲线。

分别取FSGA、FSGD、FSGE溶液1.0mL，FSGB、FSGC溶液0.5mL，用蒸馏补足至1.0 mL，再分别加蒸馏水4.6 mL，然后加入0.1 mL1.0N福林-乔试剂，快
速混合均匀，室温放置3 min。

再加入2%碳酸钠溶液0.3 mL，快速混合均匀，
室温放置120 min，中间不断振摇，760 nm测吸光度。

每个样品重复3次，代
入回归方程，计算，即得。

1.3.5 DPPH自由基清除率的测定分别取0.2，0.4，0.8，1.6，1.8，
2.0 mg·mL-
1的样品溶液1.0mL到10mL离心管中，加入0.08mol/L的DPPH溶液3.0mL，
在室温下避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，在517nm波长下测定吸光
值[10]。

按以下公式计算DPPH自由基清除率，实验重复3次。

DPPH自由基清除率（%）=[A0-(As-Ac)]/A0×100%；公式中，A0—3.0mL DPPH+1.0mL无水乙醇的吸光度值；As—3.0mL DPPH+1.0mL样品溶液的吸光度值；Ac—3.0mL无水乙醇+1.0mL样品溶液的吸光度值。

1.3.6 还原力的测定取0.2，0.4，0.8，1.6，1.80，
2.0 mg·mL-1的样品溶液
1.0mL置10mL离心管中，加入pH=6.6的磷酸盐缓冲液与1%的铁氰化钾溶液
各2.5mL，将混合液在50℃水浴中保温20min，加入10%三氯乙酸溶液2.5mL，混合溶液离心10min（3000r/ min）。

取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 的0.1%三氯化铁溶液，混合溶液于700nm波长处测吸光度[11,12]，以BHT为阳性对照，实验重复3次。

1.3.7 总的抗氧化活性的测定分别取0.2，0.4，0.8，1.6，1.8，
2.0mg·mL-1的
样品溶液1.0mL到10mL离心管中，加入包括0.6mol/L的硫酸、28mmol/L的
磷酸钠、4mmol/L的钼酸铵的试剂溶液3.0mL。

在95℃水浴锅中，分别将混合
液水浴30、60、90、120、150min。

放冷至室温，于695nm处测定其吸光度值[12,13]。

以蒸馏水为空白，BHT为阳性对照，实验重复3次。

1.3.8 统计学方法采用SPSS13.0统计软件包处理数据。

各组数据均采用均数±标
准差（±s）表示。

2.1 土茯苓各洗脱部位的制备 1.7864g土茯苓总黄酮上HPD-300型大孔树脂，分别用水、30%的乙醇、50%的乙醇、70%的乙醇、90%的乙醇洗脱、浓缩至干后
得到FSGA、FSGB、FSGC、FSGD、FSGE五个不同的土茯苓洗脱部位，称重，
各洗脱物干粉总得率为2.11%。

2.2 样品的总黄酮含量芦丁标准曲线的回归方程：Y=1.5839X+0.0065，
r=0.9999。

式中：X为芦丁标准品浓度（mg·mL-1）；Y为芦丁在510nm波长
处测定的吸光值。

五个洗脱部位中FSGB的总黄酮含量最高，达到
（99.89±2.99）%；FSGA的总黄酮含量最低，为（0.60±0.01）%，结果见表1。

2.3 样品的多酚含量没食子酸标准曲线回归方程为Y=0.8521X+0.0068；
r=0.9997。

式中：X为没食子酸标准溶液的浓度（mg·mL-1）；Y为没食子酸在760nm波长处测定的吸光值。

五个洗脱部位中FSGC中总酚含量最高，达到（47.42±1.41）%；FSGA中总酚含量最低，为（16.09±0.48）%，结果见表2。

2.4 DPPH自由基清除率由图1可知，以FSGB清除能力最好，FSGC、FSGD次之，FSGA清除能力最弱。

当样品浓度≥0.6mg·mL-1时，FSGB、FSGC、FSGD、FSGE对DPPH自由基清除效果均达到80%。

2.5 还原力不同土茯苓洗脱部位的还原力都随其浓度的升高而增强。

且FSGB、FSGC的还原能力与BHT相当，可见，FSGB、FSGC具有较强的还原能力。

见图2。

2.6 总的抗氧化活性土茯苓各洗脱部位对Mo(VI)离子均呈较好的还原力。

随着各
溶液浓度的增加，各洗脱部位与BHT对Mo（VI）离子的还原力逐渐增强。

与BHT相比，FSGB、FSGC、FSGD及FSGE对 Mo(VI)离子的还原力相对较强，而FSGA相对较弱（见图3）。

各样品（C=0.2mg·mL-1）对Mo(VI)离子的还原力
大小为FSGB>FSGC>FSGE>FSGD>BHT>FSGA。

见图4。

本研究结果发现，土茯苓大孔树脂洗脱物干粉总得率为2.11%，其中FGSB、FGSC的总黄酮含量分别高达(99.89±2.99)%与(97.94±2.61)%，可见，土茯苓中黄酮类化合物中亲水性物质较多，多以黄酮苷类存在。

在土茯苓黄酮的分离纯化工艺中，我们分别采用60%乙醇为溶剂作提取剂，超声功率80%，超声时间30min，料液比1：25（g:mL），提取土茯苓总黄酮[7]，将提取液上HPD300大孔树脂
后经过不同浓度乙醇洗脱。

结果表明，各洗脱部位的黄酮含量高低次序为FSGB>FSGC>FSGD>FSGE>FSGA。

陈广耀等研究发现，土茯苓脂溶性物质的主要成分为β-谷甾醇、柚皮素、白藜芦醇及其他二氢黄酮类物质[14]。

临床研究表明，土茯苓在关节炎、复发性口疮、白塞氏病、头痛、偏头痛、泌尿系感染、前列腺炎、膀胱炎及肿瘤等的防治方面均具有一定疗效[15]。

本课题组前期研究发现土茯苓提取物在调节肾性高血压方面具备一定疗效[16]，其作用机制可能通过改善肾性高血压大鼠体内血液流变学及体内氧化应激而实现[5]。

为了阐明土茯苓调节氧化应激的药效物质基础：我们对其水溶性物质，分离、纯化了土茯苓多糖，发现其具有良好的体外抗氧化活性[6]；对其脂溶性物质，我们则采用60%乙醇提取土茯苓总黄酮，运用HPD300型大孔树脂分离、纯化了土茯苓黄酮类物质，证明了其通过抑制细胞内质网或肌浆网中RyR 受体从而抑制细胞内钙的释放而实现抗心肌肥厚[17]。

本研究结果表明，土茯苓醇提物的5个大孔树脂不同极性的乙醇洗脱部位均具有一定的抗氧化活性，且各部位的体外抗氧化活性与其黄酮含量呈现一定的相关性。

其中FGSB与FGSC呈现了总黄酮含量高，产品得率高[(70.15±1.42)%、(26.70±1.21)%]的两个特点，具有较好的产业化开发应用前景。

因此，土茯苓多酚（黄酮）类物质可能是其抗肾性高血压的药效物质基础之一。

然而，其化学成分分析与体内调节氧化应激的作用机理有待我们进一步研究。

References:
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010版.北京:中国医药科技出版社,2010:17. State Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the people’s Republic of China[S].2010 edition.Beijing:Chi nese Medicine Industry Press,2010:17.
[2]孙晓龙,王宽字,张丹琦.土茯苓注射液对大鼠血栓形成影响的实验研究[J].中国中医药科技,2004,11(4):229-231. Sun X.L.,Wang K.Z.,Zhang D.Q.Experimental Study on Effect of Smilax Glabra Injection on Thrombosis in Rats
[J].Chinese Journal of Traditional Medical Science and
Technology,2004,11(4):229-231.
[3]徐婷婷,承志凯,尹莲,等.土茯苓抑制黄嘌呤氧化酶活性的物质基础研究[J].中药材,2012,35（4）：582-585. Xu T.T.,Cheng Z.K.,Yin L.,etal.Study on the Material Foundation of Smilax Glabra Inhibit Xanthine Oxidase
Activity[J].Journal of Chinese Medicinal Matrials, 2012,35(4):582-585. [4] Cozzi R.,Ricordy R.,Aglitti T.,et al.A scorbic acid and β-carotene as modulators of oxidative damage[J].Carcinogenesis,1997,18:223-228. [5]张利棕,寿旗扬,王德军,等.土茯苓对肾性高血压大鼠血液流变学和氧化应激的影响[J].浙江中医药大学学报,2012, 36(7):803-805. Zhang L.Z.,Shou Q.Y.,Wang D.J.,et al.Effects of Smilax glabra on Hemorheology and Oxidative Stress in Renovascular Hypertensive Rats[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2012,36(7):803-805.
[6]郑林龙,蒋剑平,许海顺,等.响应面法优化土茯苓多糖的提取工艺及抗氧化活性研究[J].中华中医药杂志,2014,29(3): 918-922. Zheng L.L.,Jiang J.P.,Xu H.S.,et al.Optimization of ultrasonic extraction of Smilax glabra polysaccharides by response surface methodology and studies on its antioxidant
activity[J].China Journal ofTraditional Chinese Medicine and Pharmacy,2014,29(3):918-922.
[7]夏道宗,于新芬,马志杰.二次回归通用旋转设计优化土茯苓总黄酮的提取工艺[J].中华中医药学刊,2009,2(7):1460-1463. Xia D.Z.,YU X.F.,Ma Z.J..Optimization ofthe Extraction of Total Flavonoids from Smilax glabra Roxb. by Quadratic Regression General Rotary Unitized Design [J].Chinese Archives ofTraditionalChinese Medicine, 2009,2(7):1460-1463.
[8] Pan Y.M.,He C.H.,Wang H.S.,et al.Antioxidant activity of microwave-assisted extract of Buddleia of cinalis and its major active
component[J].Food Chemistry,2010,121: 497-502.
[9] Huang Y.S.,Ho S.C..Polymethoxy avones are responsible for the anti-in ammatory activity of citrus fruit peel[J]. Food Chemistry,2010,119:868-873.
[10]Hayat K.,Zhang X.M.,Chen H.Q.,et al.Liberation and separation of phenolic compounds from citrus mandarin peels by microwave heating and its effect on antioxidant activity[J].Separation and Puri?cation Technology,2010,73: 371-376.
[11]LeBlanc B.W.,Davis O.K.,Boue S.,et al.Antioxidant activity of Sonoran Desert bee pollen[J].Food Chemistry, 2009,115:1299-1305.
[12]蒋剑平,徐敏,卢烨琳,等.白花蛇舌草多糖的抗氧化活性研究[J].中华中医药学刊,2012,30(5):1076-1078. Jiang J.P.,Xu M.,Lu Y.L.,et al.Antioxidant Activity of Polysaccharide from Hedyotis diffsua Willd[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,2012,30(5): 1076-1078.
[13]HayatK.,Zhang X.M.,Farooq U.,etal.Effectof microwave treatment on phenolic content and antioxidant activity of citrus mandarin
pomace[J].Food Chemistry,2010, 123:423-429.
[14]陈光耀,沈连生,江佩芬.土茯苓化学成分的研究[J].北京中医药大学学
报,1999,19(1)：44. Chen G.Y.,Shen L.S.,Jiang P.F..Studyom Chemical component of Smilax glabra[J].Journal of Beijing University of Tradition Chinese Medicine,1999,19(1):44.
[15]陈志颜,陈于翠.土茯苓临床应用及作用机理研究现状[J].亚太传统医
药,2014,10(1):42-43. Chen Z.Y.,Chen Y.C..The ClinicalApplication and
Mechanisim advance of Smilax -Pacific Traditional Medicine,2014,10(1):42-43.
[16]王德军,张利棕,方明笋,等.土茯苓对肾性高血压大鼠血压的调节作用和机制 [J].中国比较医学杂志,2011,21（12）: 46-50. Wang D.J.,Zhang L.Z.,Fang M.S.,et al.Regulatory Effects and Mechanism ofSmilax glabra on Blood Pressure in Renovascular Hypertensive Rats[J].Chinese Journal of Comparative Medicine,2011,21(12):46-50.
[17]Shou Q.Y.,Pan S.Z.,Tu J.,et al.Modulation effect of Smilax glabra flavonoids on ryanodine receptor mediated intracellular Ca2+release in cardiomyoblast cells[J].Journal of Ethno pharmacology,2013,150:389-392.。