ISSR分子标记及其在植物遗传育种中的应用

２０世纪８０年代中期以来，由于ＰＣＲ技术的
出现，基于ＰＣＲ技术的分子标记，如随机扩增多
态性ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）、
微卫星（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）或称简单序列重复（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）、
扩增片段长度多态性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）等受到广泛重视和应用。

ＳＳＲ标记技术根据微卫星序列两侧的保守序列设计引物，对串联重复的微卫星序列进行ＰＣＲ扩增，结果可以显示出ＳＳＲ拷贝数的差异，该技术重复性和稳定性都较好，被广泛用于遗传作图、种质鉴定等研究中（ＳｅｎｉｏｒａｎｄＨｅｕｎ，１９９３；ＷｕａｎｄＴａｎｋｓｌｅｙ，１９９３）。

但由于ＳＳＲ两侧引物具有物种特异性，具体实验中引物设计费时耗力，这在一定程度上阻碍了该技术的广泛应用（Ｋｏｊｉｍａｅｔａｌ，１９９８）。

ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）又称简单
重复序列间扩增，是在ＳＳＲ基础上发展起来的一
类新型的分子标记技术，其引物开发费用低，具有操作简单，比ＲＡＰＤ和ＲＦＬＰ能揭示更高的多态性，目前，ＩＳＳＲ标记已广泛地用于遗传作图、品种鉴定、遗传多样性、基因定位、系统发育、分子标记育种等方面。

１ＩＳＳＲ技术原理及特点
植物基因组中分布有大量的重复序列，根据
其在基因组中的含量可分为轻度、中度和高度重复序列，根据其分布特征可分为散在重复序列和串联重复序列，ＳＳＲ是一种高度串联重复序列，重复基序为２～６ｂｐ，分布于常染色质区，是真核生物基因组重复序列的主要组成部分，均匀分布
于基因组中（何平，１９９８），正是基于基因组的这种特点，才出现了ＳＳＲ和ＩＳＳＲ技术。

ＩＳＳＲ是基于ＳＳＲ发展起来的一种新型分子标记技术，它的基本原理就是在ＳＳＲ的３’端或５’端加锚１～４个嘌呤或嘧啶碱基，并以此作为引物，通常为
１６～１８个碱基序列，对两侧具有反向排列ＳＳＲ的
一段ＤＮＡ序列进行扩增，然后进行电泳、染色，
根据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间ＩＳＳＲ标记的多态性。

此外，ＩＳＳＲ技术的原理和操作与ＳＳＲ、ＲＡＰＤ非常相似，只是引物设计要求不同，但其产物多态性远比ＲＦＬＰ、ＳＳＲ、ＲＡＰＤ更加丰富，可以提供更多的关于基因组的信息（Ｂｌａｉｒｅｔａｌ，１９９９；Ｇｉｌｂｅｒｔｅｔａｌ，１９９９）。

ＩＳＳＲ标记结合了ＲＡＰＤ和ＳＳＲ的优点，具有模板需要量少、多态性丰富，无需试剂盒、结果记录方便、实验成本低、操作简单、实验稳定性较高等优点，缺点是
ＰＣＲ扩增时最适反应条件需要一定时间摸索，其
标记大多为显性标记，在解决交配系统、计算杂合度和父系分析等问题时效果不佳。

２
ＩＳＳＲ技术操作要点
与其他基于ＰＣＲ技术的分子标记方法一样，ＩＳＳＲ技术也主要包括ＤＮＡ提取、ＰＣＲ扩增、
电泳检测、观察结果及统计分析等步骤。

２．１ＤＮＡ提取
可采用常规方法提取用于ＩＳＳＲ分析的ＤＮＡ
样品，如ＳＤＳ法或ＣＴＡＢ法。

ＤＮＡ一般不用纯化，但需对ＤＮＡ样品进行电泳，检验其质量，并用分光光度计检测ＤＮＡ浓度及其与蛋白质比值。

用无菌水将ＤＮＡ稀释到１０ｎｇ／ｕｌ的浓度，贮
ISSR 分子标记及其在
植物遗传育种中的应用
肖海峻
１，２
，孟利前１，李玉冰
１
（１．北京农业职业学院，北京
１０２４４２；２．中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特０１００１０）
摘要：简单重复序列间扩增（ＩＳＳＲ）技术以其丰富的多态性、共显性遗传、重复性好、操作简单、引物设计简
单、实验成本低等优点正广泛用于植物遗传育种的研究中，文章简要介绍了ＩＳＳＲ标记技术的原理、特点、操作要点及在植物遗传图谱构建、基因标记、遗传多样性、种质资源鉴定及植物分类进化研究中的应用。

关键词：ＩＳＳＲ；分子标记；植物；应用中图分类号：Ｓ３３；Ｑ７５
文献标识码：Ａ
文章编号：１００７－０９０７（２００６）０４－００３１－０３
收稿日期：２００６－０６－１０
作者简介：肖海峻（１９６６－），女，内蒙古武川县人，讲师，中国农业科学院博士研究生，研究方向为牧草种质资源。

内蒙古农业科技２００６（４）：３１～３３
ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＡｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
存在零下２０℃或零下７０℃冰箱中备用。

２．２引物设计
引物设计是ＩＳＳＲ技术中最关键、最重要的一步。

基因组中ＳＳＲ一般为２～６个寡聚核苷酸，用于ＩＳＳＲ的引物常为５’或３’端加锚的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列，重复次数（ｎ）一般为４～８次，使引物的总长度达到２０ｂｐ左右。

５’或３’锚定的碱基数目一般为１～４个，锚定的目的是引起特定位点退火，使引物与相匹配ＳＳＲ的一端结合，而不是中间，从而对基因组中特定片段进行扩增、检测。

在植物基因组中最多的ＳＳＲ是（ＡＴ）ｎ、（ＴＡ）ｎ、（ＧＡ）ｎ、（ＣＴ）ｎ等二核苷酸重复序列（Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚｅｔａｌ，１９９４）。

因而在选择ＩＳＳＲ引物时，应以二核苷酸重复序列为主，少选寡聚三核苷酸、四核苷酸引物；此外，尽管ＩＳＳＲ引物为通用引物，不像ＳＳＲ引物那样需根据物种基因组特征合成引物，但研究中仍发现不同植物类群中，能够扩增出带纹的引物存在较大差异（王建波，２００２）。

２．３扩增反应
在确定了引物之后，就可以在ＰＣＲ仪上对基因组中的ＳＳＲ序列进行扩增了，扩增步骤与ＲＡＰＤ技术相似，但不同引物、不同植物材料的扩增条件存在差异，为了保证得到清晰、准确的电泳谱带，必须对扩增条件进行优化，包括对Ｔａｑ酶、引物浓度及其退火温度、Ｍｇ２＋浓度、模板浓度的优化。

为了增加可比性，对Ｔａｑ酶，用同一引物扩增时要尽量选用同一家公司同一批次的产品。

不同材料、不同引物最适Ｍｇ２＋浓度需要通过实验确定，绝大多数ＩＳＳＲ、ＰＣＲ反应体系中Ｍｇ２＋浓度为１．５～３．０ｍｍｏｌ／Ｌ；在ＩＳＳＲ扩增反应中，不同的实验体系和不同的物种，引物浓度是不同的；同一物种，随引物的不同，退火温度亦不一样，应设计几个温度梯度，反复调试，选出最适宜的退火温度，目前，大多数ＩＳＳＲ实验采用的引物退火温度在５２℃左右。

ＩＳＳＲ反应对模板含量不太敏感，主要取决于研究类群与模板纯度。

２．４电泳及染色
ＰＣＲ产物需经电泳分离、染色显示后才能进行谱带观察、统计。

目前，ＤＮＡ分离中所用的电泳介质都可以用于ＩＳＳＲ扩增产物的分离，琼脂糖浓度常用１．５％～２．０％，聚丙烯酰胺常用浓度为６％，后者的分离效果更好。

用硝酸银或溴化乙啶（ＥＢ）染色后，在可见光（银染）或紫外光（ＥＢ染色）下进行观察，统计带纹的有（记为１）或无（记为０）及相对位置，然后可根据研究目的，应用相关软件进行分析。

３ＩＳＳＲ标记在植物遗传育种中的应用
３．１遗传图谱构建及目的基因标记
构建遗传图谱研究的目的是寻找足够的多态分子标记，从而将所有基因定位到特定染色体的特定区域，最好是在染色体步查距离内。

由于ＩＳＳＲ标记可以揭示高度多态性，又遍布于染色体上，因此，它是绘制遗传连锁图的理想标记，从Ｋｏｊｉｍａ等首先将ＩＳＳＲ标记用于一粒小麦遗传图谱构建以来，ＩＳＳＲ已成功地用于小麦（ＮａｇａｏｋａＴ，ＯｇｉｈａｒａＹ，１９９７）、马铃薯（ＰｒｅｖｏｓｔＡ，１９９９）、柑橘（ＦａｎｇＤＱ，１９９９）、桃（ＤｉｒｌｅｗａｎｇｅｒＥ，１９９８）、欧洲和日本落叶松（ＤａｖｉｌａＪＡ，１９９９）、欧洲草莓（ＣｅｋｉｃＣ，２００１）、苹果（ＮｙｂｏｍＨ，１９９０；宣继萍，２００２）等作物的遗传图谱的构建，ＩＳＳＲ遗传图谱可以与同工酶、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ遗传图谱相互参照，相互补充，如在一粒小麦和柑橘中，ＩＳＳＲ标记分布于整个染色体组，其在图上所处的位置与ＲＦＬＰ相似，并可在ＲＦＬＰ图谱上标记稀少的区域增加标记，使饱和度增加，分子标记间距离缩小（ＡｉｎｏｕｃｈｅＭＬ，１９９７）。

利用ＩＳＳＲ标记进行作物基因定位的研究已在小麦和水稻中取得了一定的成果，Ａｍｍｉｒａｊｉ等（２００１）用ＩＳＳＲ标记找到了７个与小麦籽粒ＱＴＬ连锁的分子标记，３个标记与小种子性状连锁，４个标记与大种子性状连锁。

Ｌｉｕ等（２００２）利用３３个ＩＳＳＲ引物定位小麦品种ＬＫ７８３中的Ｋ型恢复基因，结果发现ＵＢＳ－８４５标记与该恢复基因连锁，定位在１Ｂ染色体上。

关荣霞等（２００２）利用４３个ＩＳＳＲ引物定位小麦Ｔ型恢复系２１１４的恢复基因，张立荣（２００４）也利用该方法对Ｔｈａｔｃｈｅｒ及２０个以Ｔｈａｔｃｈｅｒ为轮回亲本的小麦近缘等基因系（ＮＩＬｓ）进行研究，发现了一个与Ｌｒ３７基因连锁的ＩＳＳＲ标记。

由此可见，ＩＳＳＲ技术在寻找与控制农艺性状连锁的分子标记中非常有用。

目前，利用该技术还找到了与抗枯萎病基因连锁的ＩＳＳＲ标记（ＲａｔｎａｐａｒｋｈｅＭＢ，１９９８ａ；１９９８ｂ）。

３．２ＩＳＳＲ在植物遗传多样性研究中的应用物种的遗传多样性是长期进化的产物，也是
３２内蒙古农业科技Ｎｏ．４
其生存和发展的前提。

对物种遗传多样性和遗传结构的研究，是探讨其适应性、生存力的基础，也是分析濒危物种致濒机理的基础，从而帮助制定科学有效地保护策略和措施。

ＩＳＳＲ分子标记目前已广泛的应用在研究银叶树（Ｊｉａｎ，２００２）、陆地棉（武耀廷，２００１）、鱼腥草（吴卫，２００３）、小麦（王心宇，２００１；张立荣，２００４）、水稻（江树业，２０００；钱韦等，２０００）、大麦（魏育明，２００４；侯永翠，２００５）、披碱草（李永祥，２００５）、油菜（马朝芝，２００３）、黑麦属（尚海英，２００４）、结缕草（胡雪花，２００５）等植物的遗传多样性，研究结果表明，ＩＳＳＲ是一种非常有效的、理想的能够揭示材料间遗传差异的分子标记，因而在遗传多样性研究方面具有广泛的应用前景。

３．３ＩＳＳＲ在种质资源鉴定中的应用
ＩＳＳＲ技术可以比ＲＦＬＰ、ＳＳＲ、ＲＡＰＤ等技术更多地揭示基因组中的多态性，是一种很好的ＤＮＡ指纹标记，因此，该技术在种质资源鉴定方面显示出比其他方法更高的优越性，目前已广泛地应用在种质资源的鉴定中。

王心宇等（２００１）利用ＩＳＳＲ标记构建亲缘关系较近的小麦品种指纹图，结果发现：（ＡＧ）ｎ、（ＡＣ）ｎ、（ＴＧ）ｎ等二核苷酸重复引物类型能将亲缘关系很近的品种或品系区分开。

杜金昆等（２００２）利用１１个ＩＳＳＲ引物就将所有供试的４７份小麦品种明显区分开来，并准确地确定各个基因型之间的遗传差异和亲缘关系。

ＰｒｅｖｏｓｔＡ（１９９８）利用４个ＩＳＳＲ引物即可对３４个品种进行鉴别，其中有２个引物单独使用即可区分出所有品种，４个引物中任何２个引物组合，扩增结果也呈现出品种特异性，并且全部检测工作可以在９ｈ内完成。

胡雪华（２００５）利用１４个ＩＳＳＲ引物对上海结缕草和结缕草属进行研究，结果表明，上海结缕草ＪＤ－１与细叶结缕草、沟叶结缕草和结缕草３个种之间不存在亲缘上的直接联系，并初步断定上海结缕草ＪＤ－１是一个新的变异材料。

由此可见，ＩＳＳＲ技术是一种快速、准确、可以产生足够多态位点的方法，在植物种质资源鉴别中将发挥越来越大的作用。

３．４ＩＳＳＲ标记在植物分类进化研究中的应用Ｊｏｓｈｉ等用ＩＳＳＲ标记分析了稻属物种遗传多样性与系统发育的关系，研究材料包括稻属的１７个野生种（基因组类型分别为ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＥＥ、ＦＦ、ＧＧ、ＢＢＣＣ、ＣＣＤＤ和ＨＨＪＪ）和２个栽培种，基于ＩＳＳＲ带纹数据的严格一致树显示稻属是多途径进化的，ＪｏｓｈｉＳＰ（２０００）认为ＩＳＳＲ标记在研究稻属植物进化关系中非常有用。

ＩＳＳＲ标记可以揭示更高的多态性，可以更好地区分种下分类群间的关系（ＨａｎｇａｎｄＳｕｎ，２０００）。

杂交和基因渐渗在被子植物进化中起着非常重要的作用，特别是与多倍体化过程相结合的时候。

目前已有一些分子标记用于揭示异源多倍体物种的形成和进化（Ａｉｎｏｕｃｈｅ，１９９７；ＤｏｙｌｅＪＪ，１９９９，蔡从利，２００１），但对二倍体或同倍性杂种的认识还不足１０种植物（ＷｏｌｆｅＡＤ，ＸｉａｎｇＱ－Ｙ，１９９８），主要困难是多倍体中亲本的遗传分化程度高，容易通过分子生物学方法认识，而二倍体或同倍性杂种的亲缘关系较近，难以用同工酶、核及叶绿体基因组限制酶图谱、ＲＡＰＤ等标记确定，而多态性丰富的ＩＳＳＲ标记则为这一问题的解决提供了契机，这在玄参科的钓钟柳属和列当科的Ｈｙｏｂａｎｃｈｅ属中已有出色的研究（ＷｏｌｆｅＡＤ，１９９８ａ，１９９８ｂ，２００１）。

综上所述，ＩＳＳＲ标记因其引物容易设计，实验重复性强，操作简单，成本低，不需要同位素，可以揭示更高的ＤＮＡ多态性，从而在植物遗传育种研究中发挥了重要作用。

但任何一种分子标记都不能解决所有问题，根据有关文献报道，在进行分子多态性标记的研究中，应该用至少两种以上标记技术进行比较研究，综合数量得出结论，这样实验结果的可靠程度要大大提高。

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（责任编辑侯旭光）
要农艺措施方案为：播期４月３－５日、密度２．０８万￣２．２４万穴／６６７ｍ２、施氮量纯氮７．５９￣８．４２ｋｇ／６６７ｍ２、氮肥底施比例６４．９％￣５５．１％。

６６７ｍ２产量超过５５０ｋｇ的主要农艺措施为播期４月４日、密度２．０４万￣２．３２万穴／６６７ｍ２、施氮量纯氮６．８６￣８．６１ｋｇ／６６７ｍ２、氮肥底施比例６５．１％￣５６．０％。

研究结果对指导黔西北高寒山区水稻高产栽培具有重要意义，可作为黔西北山区毕粳４１号示范推广高产栽培技术规程。

（责任编辑侯旭光）
表６毕粳４１号６６７ｍ２产量超过５００ｋｇ和５５０ｋｇ的农艺措施方案及频率分布
产量指标项目
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４
次数频率次数频率次数频率次数频率
６６７ｍ２＞５００ｋｇ
－２００００００１８０．１６３６
－１２８０．２５４５２００．１８１８１９０．１７２７３４０．３０９１
０５４０．４９０９４２０．３８１８３７０．３３６４３５０．３１８１
１２８０．２５４５４１０．３７２７３６０．３２７２２００．１８１８
２００７０．０６３６１８０．１６３６３０．０２７３合计１１０１１１０１１１０１１１０１Ｘｉ００．３１８００．４８２０－０．４０００ＳＸｉ０．０６８００．０８０００．０９２００．１０００
９５％分布区间－０．１３３￣０．１３３０．１６１￣０．４７５０．３０２￣０．６６１－０．５９６￣－０．２０４农艺措施方案４月３－５日播种２．０８万￣２．２４万穴／６６７ｍ２纯氮７．５９￣８．４２ｋｇ／６６７ｍ２
氮肥底施比例
６４．９％￣５５．１％
６６７ｍ２＞５５０ｋｇ
－２００００００００
－１００００１０．０９０９４０．３６３６
０１１１７０．６３６４５０．４５４５５０．４５４５
１００４０．３６３６５０．４５４５２０．１８１８
２００００００００合计１１１１１１１１１１１１Ｘｉ００．３６４００．３６４０－０．１８２０
ＳＸｉ００．１４５００．１９４００．２１６０９５％分布区间００．０７９￣０．６４８－０．０１６￣０．７４４－０．６０５￣－０．２４１农艺措施方案４月４日播种２．０４万￣２．３２万穴／６６７ｍ２纯氮６．８６￣８．６１ｋｇ／６６７ｍ２氮肥底施比例
６５．１￣５６．０％变量水平
变量水平
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