壳寡糖的研究进展和应用前景1

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壳寡糖的研究进展和应用前景
陈海燕1,张彬1,何勇松2
(1.湖南农业大学动物科技学院特种经济动物研究所,湖南长沙410128;2.湖南广安生物
技术有限公司,湖南长沙410129)
收稿日期:2006-12-06
开发利用具有无污染、无残留、不产生耐药
性,同时可提高动物机体抵抗能力,预防动物疾病的绿色环保促生长的新型饲料添加剂已经成为当今畜牧业生产的必然趋势。

素有“人体第六生命要素”、“软黄金”之美誉的甲壳素(几丁质,Chitin)广泛存在于海产品和丝状菌类中。

但由于其不溶于水,在开发应用上受到了很大的限制。

而壳寡糖(又称寡聚氨基葡糖、甲壳低聚糖,ChitosanOligosaccharide,Chito-oligosaccharide,Oli-gochitosan)由甲壳质(几丁质)脱乙酰化的产物壳聚糖降解获得,是由2~10个氨基葡糖通过β-1-4糖苷键连接而成的低聚糖,也是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖,水溶性好,易被动物体吸收。

本文通过对国内外学者近几年来对壳寡糖的制备、生理功能和作用机制的研究进行综述,提出了其在动物生产中的应用和市场前景。

1壳寡糖的消化吸收机制
哺乳动物产生的内源性消化碳水化合物的酶
(主要是唾液淀粉酶、胰淀粉酶)对碳水化合物的
消化主要作用于α-1,4糖苷键,而对其它类型的糖苷键不能分解或分解能力较弱。

壳寡糖是由N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1,4糖苷键结合而成的多糖,不能被哺乳动物胃酸和消化酶降解。

但是人体中应用的壳聚糖如手术缝合线、营养保健品及其它可吸收型医用植入材料等均是通过人体血清中所含的溶菌酶降解后被人体吸收。

由于壳寡糖水溶性大于99%,也有研究发现高脱乙酰度的壳寡糖对于打开细胞间连接效果最显著,可通过动
物肠道上皮细胞直接被吸收[1],据报道被人体吸收率可达到99.88%。

因此,它比几丁质和壳聚糖
具有更优越的生物活性。

2壳寡糖的制备研究进展
2.1化学制备法降解壳聚糖的化学方法包括酸解法、氧化降解法及硼酸钠降解法等。

2.1.1酸解法酸对壳聚糖的解聚是一种最基本和最简单的方法。

它是利用壳聚糖分子中存在众多的游离氨基能够与溶液中氢离子结合的特点,引起壳聚糖分子间与分子内部的氢键断裂,使分子结构舒展,而长链部分易发生糖苷键断裂,形成许多聚合度不等的分子片段。

一般采用浓盐酸水解,因其产物单糖较多,而壳寡糖含量低,消耗大量盐酸,反应条件苛刻,需大量离子交换树脂,工艺烦琐,后处理麻烦,同时这一工艺易给环境带来巨大的压力[2],故不够理想。

而利用醋酸法制备的壳寡糖产品具有可以长期保存的优点,特别适用于食品及化妆品寡糖的生产。

此外,还可采用浓硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、三氧乙酸和甲酸等无机酸和有机酸降解甲壳质。

2.1.2氧化降解法氧化降解法是近年来国内外研究比较多的壳聚糖降解方法。

其中的过氧化氢(H2O2)氧化降解因成本低、降解速度相对较快、产品分子量低且分布窄,无残毒、易实现工业化而倍受关注。

其它氧化降解方法有紫外线辐射(UV)/H2O2,NaCl/H2O2等。

H2O2氧化降解壳聚糖的收率受浓度、温度、pH值及反应时间的影响。

酸性条件下H2O2对壳聚糖的
摘要:壳寡糖是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖。

本文阐述了壳寡糖的消化吸收机制、制备方法、生理功能和作用机制的研究进展及其在动物生产中的应用前景。

关键词:壳寡糖;制备方法;生理功能;作用机制
中图分类号:S816.7
文献标识码:A文章编号:1005-8567(2007)02-0017-04
广东畜牧兽医科技2007年(第32卷)第2期专题综述
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氧化降解可制备分子量小于10000的壳聚糖;在中性条件下H2O2对壳聚糖的氧化降解反应中制备了分子量为1000左右的药用低聚氨基葡萄糖。

水解温度80~90℃,H2O2浓度8%~10%,水解时间0.5~1.0h时,水溶性产品的收率为40%~45%,聚合度为3~7的壳寡糖占水解产物的36%~50%,有望进行工业化生产壳寡糖[3]。

此外,还可利用微波辐射辅助降解,其最优化反应条件为:5%过氧化氢、5%壳聚糖、微波辐射功率400w,辐射时间3min,所得壳寡糖分子量为11000,收率为60%[4]。

2.1.3硼酸钠降解法据报道此法制备过程简单,所得的壳寡糖不仅溶于水,而且在二甲乙酰胺和二甲亚砜等有机溶剂中有很好的溶解性[5]。

2.1.4化学合成法化学合成法可以通过精心设计基质合成特殊结构的低聚糖。

随着近几年糖化学的兴起,壳寡糖的合成也日益受到研究者的关注。

AntjeRottmann等[6]利用几丁质酶制备了壳聚糖和壳聚糖的杂环衍生物,而且还具有生物活性。

FridmanMicha等[7]运用一锅煮的方法制备了壳寡糖三糖和四糖,产率在51%~80%之间。

这种方法的优点就是可以根据自己的需要来设计寡糖。

2.2物理制备法
2.2.1超声波法和微波法在上世纪80年代末期,我国学者王伟等[8]将甲壳质脱乙酰化后,溶于乙酸溶液中,在60℃条件下用超声波处理,发现壳聚糖粘度明显下降,而降解过程中对氨基的含量没有影响。

微波辐射法近年来也引起了人们的研究兴趣。

李鹏程等(2004)将聚合度为3~150,相对分子量在600~30000之间的壳聚糖加入含有NaCl或KCl或CaC12的电解质稀酸溶液中,以480~800W的微波辐射能量,降解反应3~12min,冷却至室温,再用2M的NaOH液中和得淡黄色絮状沉淀;再在4℃冷藏柜中沉淀30min,抽滤,所得滤饼再在60℃下烘干,粉碎,即得甲壳低聚糖化合物。

此方法能够降低能耗,减少污染,节省时间和原料,具有产业化前景和广泛的市场潜力。

2.2.2γ射线照射下辐射降解辐射降解是在放射性射线照射下,使壳聚糖分子产生电离或激发的物理效应,进而导致分子链断裂。

李治等[9]用放射性钴在大气和真空下照射相对分子量为2.74×105的壳聚糖,得到一系列低聚合度壳聚
糖,而且不但没有破坏氨基含量,反而含量增加。

2.2.3光降解法紫外线、
可见光和红外线对壳聚糖的辐照也可以降解壳聚糖,当辐照的波长小于360nm时降解反应较明显。

红外光谱表明,光降解过程中壳聚糖分子链上的乙酰氨基葡萄糖单元发生脱乙酰化反应,导致氨基的数量增加,同时使β-(1,4)糖苷键断裂,但是降解过程中生成
羰基。

Viviana等[10]发现在用紫外光-可见光度计测壳聚糖的降解程度时发现,在紫外光照射下,壳聚糖的降解程度有所提高,这也说明了紫外光也能促进壳聚糖降解成壳寡糖。

2.3酶降解法酶降解法与其它降解方法相比,具有反应条件温和,降解过程及降解产物相对分子量分布容易控制,制备的低聚壳聚糖生物活性高,产物不用除盐,过程容易控制,且不对环境造成污染等优势,是理想的降解方法。

酶法降解壳聚糖分为专一性酶和非专一性酶降解。

几丁质酶、壳聚糖酶、甲壳胺酶、溶菌酶和N-乙酰葡萄糖胺酶能专一性水解壳聚糖;糖酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶和里氏木酶等在内的30多种水解酶有部分和完全非专一性水解作用[11]。

Zhang等[12]研究了复合酶降解法制备壳寡糖的方法,发现用纤维素酶、a-淀粉酶和蛋白酶复合降解与膜分离耦合使用,可将脱乙酰度为24%的壳聚糖降解为聚合度为3~10的壳寡糖。

2.4糖基转移法糖基转移法是建立在酶反应基础上的,利用低聚合度寡糖在酶参与作用下,延长糖链成为高聚合度寡糖。

具有糖基转移能力且能合成甲壳低聚糖的酶主要有溶菌酶和精致甲壳质酶。

糖基转移反应受温度、pH值、底物浓度和反应时间等因素影响。

此方法主要得到六糖和七糖。

2.5复合降解法单一降解法各具优势,
但又存在各种问题。

复合降解法的出现使低聚壳聚糖的制备进入了一个新的阶段,它是通过对各种单一降解法优缺点分析后进行优化组合,或引入较新的分离技术以实现工业化生产。

鉴于纤维素酶活力较低,降解时间长,降解产物平均分子量大且分布较宽,林强等先采用纤维素酶催化降解壳聚糖,在反应的后期加入少量的H202继续氧化降解,这种复合降解工艺可以获得平均分子量在1500的降解产物。

且纤维素酶和H202的用量以及降解时间均低于单一降解法。


专题综述壳寡糖的研究进展和应用前景—陈海燕,等
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昱光等[13]采用酶降解体系与膜分离技术相合,通过选择不同孔径及不同的膜操作参数,在降解过程中将降解完成的产物及时取出,以加快降解进程和控制反应程度。

目前,该工艺已经实现工业化生产。

可见,随着低聚壳聚糖制备研究的深入,将会出现更多的、更实用的复合降解工艺。

3壳寡糖的生理功能及作用机理研究进展3.1调节肠道微生态
3.1.1壳寡糖具有抑制消化道内有害菌的作用在酸性条件下,壳寡糖分子中的游离氨基质子化,质子化铵能与细菌带正电的细胞膜作用,干扰细菌细胞膜功能,造成细菌体内细胞质流失,对真菌和微生物的生长有抑制作用。

其抗菌活性与菌种和浓度有关,且随浓度加大其抗菌活性增强,高浓度时有杀菌作用。

0.2%分子量为950~1350的壳寡糖溶液在酸性条件下对大肠杆菌和金色葡萄球菌均有明显的抑制作用[1]。

用改良双氧水降解法制备的壳寡糖通过营养琼脂培养基涂布法和滴注法检测其抗菌活性表明,壳寡糖对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌均有抑制作用,且其抗菌活性金黄色葡萄球菌>大肠埃希氏菌>枯草芽孢杆菌>白假丝酵母菌[14]。

3.1.2壳寡糖具有促进双歧杆菌生长的功能从目前已报道的双歧杆菌促生长因子(Bifidusfactor,BF)研究结果分析,甲壳低聚糖是BF的一种重要种类,它能调节动物肠道内微生物的代谢活动,改善肠道微生物区系分布,促进双岐杆菌生长繁殖,从而提高机体免疫力,使肠道内pH下降,抑制肠道有害菌生长,产生B族维生素,分解致癌物质,促进肠蠕动,增进蛋白质吸收。

大量实验表明,双岐杆菌通过分泌到细胞外各种酶来分解利用不同的BF,并促进其生长繁殖;而有一些BF是通过蛋白质类的黏附素来产生作用的,因为黏附素可使肠道上皮细胞和双岐杆菌连接在一起[15]。

3.2改善肠道组织形态,提高动物的生产性能壳寡糖使回肠微绒毛密度增加,同时也有变细、变高的倾向。

微绒毛高度增加,密度加大,利于增大小肠的吸收面积,促进营养物质的吸收,提高饲料的利用率。

日粮中添加0.1%壳寡糖可促进肉用仔鸡回肠微绒毛的生长发育,8周龄体重比对照组提高18%,料重比降低3.4%,显著提高肉用仔鸡的生产性能[16]。

日粮中添加壳寡糖100~150mg/kg可提高肉用仔鸡回肠的消化性能,提高生产性能[17]。

还有实验表明,壳寡糖可使大鼠十二指肠和空肠的绒毛长度增长以及黏膜增厚,且单位面积内的肠黏膜碱性磷酸酶(AKP)活性增强,提高肠道的消化性能[18]。

3.3增强免疫功能壳寡低聚糖的免疫增强作用目前已被许多学者证实,其抗感染作用机制有以下几种解释:①壳寡糖刺激机体,促进腹膜渗出液的细胞(PEC)数量增加,激活巨噬细胞,从而增加活性氧的生成,再通过氧化性杀菌机制产生作用;②壳寡糖对巨噬细胞的直接激活作用增加了巨噬细胞的杀伤活性;③壳寡糖激活T淋巴细胞而显示杀伤活性,且致敏T细胞诱发迟发性超敏反应;④壳寡糖激活T淋巴细胞,从而促使巨噬细胞激活因子(MAF)的释放,进而激活巨噬细胞。

在激活过程中,巨噬细胞直接被壳寡糖激活又能提高它对MAF的敏感性,使它进一步激活。

因此认为壳寡糖的杀伤活性的产生主要是激活T淋巴细胞与巨噬细胞相互作用加强的结果。

Shigehiro等将壳低聚糖注射到兔静脉中,发现可以提高血浆中溶菌酶活性2~3倍,大大增强了兔对致病菌的免疫力。

刘艳如等研究发现水溶性壳聚糖能明显提高正常小鼠巨噬细胞的吞噬功能,提高绵羊红细胞诱导的血凝素抗体和溶血素的生成[20]。

添加0.1%壳寡糖的日粮可使肉用仔鸡胸腺和法氏囊相对重量增加(P<0.05),血清新城疫抗体效价提高(P<0.05),免疫力明显提高[16]。

日粮中添加0.05%壳寡糖胸腺、脾脏和腔上囊相对重均优于对照组(P<0.01),与5mg/kg的黄霉素组差异不显著,但优于抗生素组[19]。

3.4抗肿瘤,增强免疫力以壳六糖为主的壳寡糖具有良好的抑制肿瘤细胞生长和抑制肿瘤转移的作用。

100mg/kg壳寡糖对小鼠S
180
肿瘤的抑瘤率大于30%[20]。

其作用机制有:①壳寡糖能促进巨噬细胞细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18基因的表达,促进巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18。

而这些细胞因子又可以反馈激活巨噬细胞和NK细胞,形成网络状的反馈调节关系,从而极大地增强机体的免疫功能和抗肿瘤能力[21];②壳寡糖通过调节bel-2、bax的表达而诱使肿瘤细胞凋亡[22]。

3.5促进骨折愈合壳寡糖可通过某种机制促
专题综述
壳寡糖的研究进展和应用前景—陈海燕,等19
・・
使成骨细胞的活性增高,使得骨形态发生蛋白(BMP)在骨折修复早期表达增强,同时表达时间提前,从而促进骨折修复[23]。

3.6抗疲劳有实验研究表明甲壳寡糖可显著降低小鼠游泳时La(糖酵解产物)的含量,降低血清中LDH活性,改善小鼠有氧供能和增进糖原贮备,提高抗疲劳能力[24]。

3.7其它功能低分子量的壳聚糖分子中的聚葡糖胺链带有4价铵离子,能粘合胆汁酸,阻止胆汁酸循环,降低脂肪吸收,增加粪中脂肪的排除量,从而减少体脂的沉积量。

小肠内胆汁酸减少,促进肝内胆固醇向胆汁酸转化,从而降低肝脏中胆固醇的含量。

其中,壳聚糖分子量在2000以上有降血脂的作用,分子量在5000时降胆固醇能力很强。

此外,甲壳低聚糖还能排除人体内重金属,增加钙和其它矿物质的吸收。

4壳寡糖在动物生产中的应用及市场前景
4.1生物兽药领域开发应用壳寡糖是甲壳质行业的至高点,也是当今生物制药技术的一个亮点。

壳寡糖在人类医疗保健方面特别是在癌症的治疗已经有了很广泛的应用,生物兽药方面的重要用途之一是利用其抗菌作用,预防或治疗由金黄色葡萄球菌、大肠埃希杆菌、放线杆菌、突变链球菌等细菌引起的动物疾病;其次,利用壳寡糖促进伤口愈合的功能,可用于动物外伤或骨折的辅助治疗;再次,因为其具有降血脂的作用,还可用于宠物肥胖症的治疗;最后,由于羧甲基壳寡糖对铁离子、锌离子和钙离子等均有良好的络合能力,有望制成新的天然补铁剂、补锌剂和补钙剂。

4.2饲料添加剂领域壳寡糖在动物生产领域的深入研究表明,壳寡糖无毒、无热源、无变异,具有特殊的生理活性和功能,如调节动物肠道内微生物代谢活动,有选择地活化、增殖有益菌生长,降低胆固醇及血脂含量,提高免疫能力和瘦肉率等。

高聚合度的壳寡糖还具有阻碍病原菌生长繁殖的功能,能促进蛋白质合成、细胞活化,从而提高畜禽生产性能。

在仔猪日粮中添加0.02%海洋寡聚糖组比对照组的死亡率、次品率均显著降低(P<0.05),14-35日龄哺乳仔猪和35-70日龄仔猪体重分别提高18%和14.2%,显著高于对照组(P<0.05)。

表明了海洋寡聚糖作为猪饲料添加剂具有良好的促生长效果[25]。

2004年,壳寡糖作为新型饲料添加剂
获得了农业部的批准。

4.3畜产品加工领域以壳聚糖、
壳寡糖为主要成分,复配以其它具有防腐、抗氧化作用的天然物质,制备而成的天然生物防腐剂,应用于食品中具有防腐、增稠、抗氧化等综合作用,可有效延长产品保质期,减少化学防腐剂对人体的危害作用,是安全、高效、新型的天然食品添加剂。

目前,壳聚糖和壳寡糖作为食用添加剂如功能性甜味剂、防腐剂已经得到了广泛的应用。

此外,甲壳素和壳聚糖及其衍生物具有无毒、无味、可降解等特点在食品加工中还可用做填充剂、增稠剂、脱色剂、稳定剂和保鲜包装膜。

5存在的问题
根据文献报道,全球虾蟹壳年产量近2000
万吨,贝类、壳类年产几丁质139万吨,发酵副产品中的丝状菌类年产几丁质9万吨。

科技部将“壳寡糖新产品的开发应用”列为国家“十五”攻关计划,要求建立数条年产500吨以上的壳寡糖生产线,2015年总产值可达1100亿~13OO亿元,以满足国内市场的需求。

但是低聚壳聚糖的制备,尤其是聚合度6~8壳寡糖的制备大都处于实验室的研究阶段。

目前,国内对H202氧化降解法研究较多,但是降解过程伴随的副反应还需要探索出有效的遏止方法,另外必须注意氧化降解对产品活性的影响以及存在残留的H202对食品安全性是否产生隐患也是值得考虑。

酶降解制备低聚壳聚糖同样受到了极大关注,但由于专一性酶价格昂贵、难以商业化,寻找其它降解效果好,价格低廉的非专一性酶,并通过物理、化学方法与酶法相结合探索出能够高效、安全生产壳寡糖的复合降解法已经成为解决问题的突破口。

与此同时,我们还要继续深入研究壳寡糖的作用机理和在各种动物中的最佳添加量,以便为壳寡糖的推广提供更加明确的理论指导。

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