溶藻弧菌HY9901vscH基因克隆及生物信息学分析

溶藻弧菌HY9901vscH基因克隆及生物信息学分析
梁彩凤;庞欢瑛;刘建勇
【摘要】[目的]克隆溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901 vscH基因,并分析其序列结构.[方法]参照GenBank上的溶藻弧菌全基因组序列设计1对特异性引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的Ⅲ型输出蛋白YopR核心家族蛋白vscH基因全长,用生物信息学手段分析VscH序列,构建VscH系统进化树及亚基三维结构模型.[结果]vscH基因序列全长636 bp,编码211个氨基酸,推导的蛋白分子质量为24.09 ku.经预测,VscH不存在信号肽与跨膜区;含有2个ASN-糖基化位点,14个磷酸化位点,2个N-豆蔻酰化位点,2个内质网靶向序列及2个微体C-末端靶信号位点;有1个主要功能域,T3SS_needle_reg(第71-211氨基酸);α-螺旋占66.35%,无规则卷曲占23.22%,延伸链占5.69%,β-折叠占4.74%;可能的B细胞抗原优势表位,分别是第20~23,25~28,37~40,48~51和109~112区段.溶藻弧菌VscH系统进化树与弧菌(Vibrio)聚为一簇.VscH亚基三维结构模型与鼠疫耶尔森菌毒力因子YopR蛋白的编码基因yscH相似.
【期刊名称】《广东海洋大学学报》
【年(卷),期】2018(038)004
【总页数】7页(P85-91)
【关键词】溶藻弧菌;vscH基因;基因克隆;生物信息学分析
【作者】梁彩凤;庞欢瑛;刘建勇
【作者单位】广东海洋大学水产学院,广东湛江 524088;广东海洋大学水产学院,广东湛江 524088;广东海洋大学水产学院,广东湛江 524088
【正文语种】中文
【中图分类】Q785;S941.42
外膜蛋白（Outer membrane protein, OMP）是革兰阴性细菌突破宿主的防御机制，导致机体发病的重要致病因子[1]，其带有多种抗原表位，可诱发机体的免疫
应答[2]，对疫苗研制有重要意义。

YopR 蛋白是外膜蛋白家族的一员，在鼠疫耶
尔森氏菌中YopR蛋白由yscH基因编码[3-4]，YscH有调节或转运Yops定位攻
击靶细胞功能[5-6]，YopR蛋白被释放到宿主细胞外环境而导致机体发病[7-8]。

外膜蛋白作为病原菌疫苗制备的重要材料，在迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）[9]、嗜水气单胞菌（A. hydrophila）[10]和鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）[11]等细菌已做了深入研究。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种嗜盐嗜温型的革兰阴性细菌，可产生黏附因子、脂多糖、III 型分泌系统、外膜蛋白
等毒力因子[12]，是引起鱼、虾、贝等水产动物肾脏发白、表皮出血、肝胰脏肿大充血等病变[13-14]，以及人伤口感染等多种疾病[15]的重要病原菌。

但少见有关
溶藻弧菌Ⅲ型输出蛋白YopR核心家族蛋白vscH基因的报道。

利用生物软件筛选、预测抗原表位可为制备更高效的亚单位疫苗提供参考[16-17]。

为探究溶藻弧菌vscH基因的功能，笔者克隆溶藻弧菌vscH基因，并对其序列理化性质、二级结
构和三级结构等进行生物信息学分析，以初步了解溶藻弧菌VscH 蛋白的表征，为研究溶藻弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。

1.1.1 载体和菌株溶藻弧菌为广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实
验室保存的强毒株HY9901[18]；克隆载体pMD18-T购自Takara公司。

1.1.2 主要试剂 RxTaq DNA聚合酶，Takara公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒，全式金公司；其他试剂为进口或国产分析纯。

抗生素氨苄西林（Ap）质量浓度为100 μg/mL。

1.2.1 溶藻弧菌HY9901总DNA提取参照庞欢瑛[19]方法培养溶藻弧菌，参照孙金福[20]方法提取溶藻弧菌HY9901总DNA，于–20 ℃下保存备用。

1.2.2 vscH基因克隆根据Genbank上溶藻弧菌全基因序列
（NZ_AAPS00000000）设计一对引物，上游引物P1：5′-ATGATCATTGATTCAAGTAAC CTAA-3′，下游引物P2：5′-CTAAGATAAATCTAA CTTGTGACTG-3′。

PCR反应体系：rTaq mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，100 μmol/L的上、下游引物各1 μL，模版1 μL。

反应程序：
95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，45 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共33个循环；72 ℃ 10 min。

经10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳后，参照DNA 胶回收试剂盒说明书回收PCR产物。

1.2.3 PCR产物测序参照试剂说明书及文献[21]进行。

1.2.4 vscH生物信息学分析用NCBI及DNAMAN进行序列同源性比对和相似性分析；ExPASy Proteomics Serv在线推导vscH基因的氨基酸序列、分子质量和
理论等电点pI等[21]；ORF Finde软件预测VscH序列的开放阅读框（ORF）；
使用SignalP 4.0 Server 预测信号肽序列；TMHMM Server 2.0进行跨膜结构域预测；SoftBerry-Psite软件预测氨基酸序列的功能位点分布；PSORT II Prediction预测亚细胞定位；Clastal 2.0及MEGA 5.0软件，构建NJ系统进化树；SWISS-MODEL程序构建三维结构。

1.2.5 VscH B细胞抗原表位预测用Chou-Fasman方法预测VscH蛋白二级结构，用Kyte-Doolittle、Karplus-Schulz、Emini 及Jameson-Wolf参数分别预
测亲水性、柔性、表面可及性和抗原表位，用DNAstar软件筛选VscH蛋白可能
的B细胞抗原优势表位。

PCR扩增得一636 bp特异条带（图1-A），阳性菌落PCR也扩增得一636 bp
条带（图1-B）。

经测序分析，vscH基因有一个636 bp的开放阅读框（ORF），
其编码211个氨基酸（图2）。

将该基因提交至GenBank，登录号为
AVR49014.1。

溶藻弧菌HY9901 VscH蛋白原子总数为3371，分子式为
C1056H1683N291O330S11。

理论分子质量24.09 ku，理论pI值为5.92。

不
稳定系数56.26，大于阈值40，因此确定该蛋白不稳定。

VscH蛋白疏水性较高，其脂肪系数76.82，总的亲水性平均系数－0.641。

该蛋白含色氨酸（Trp）和半
胱氨酸(Cys)，280 nm处的摩尔吸收系数为2 647 m2∙mol-1。

碱性氨基酸（Arg + Lys）总数27，酸性氨基酸（Asp + Glu）总数32，N末端为甲硫氨酸（Met）。

在酵母中表达的半衰期大于20 h ，在大肠杆菌中表达的半衰期大于10 h，而在哺乳动物网状细胞中体外培养表达的半衰期为30 h。

分析发现，VscH氨基酸序列的N端无信号肽，无跨膜区。

该氨基酸序列含有2
个ASN-糖基化位点，14个磷酸化位点（6个蛋白激酶C磷酸化位点，1个酪氨
酸激酶磷酸化位点和7个酪蛋白激酶II磷酸化位点），2个N-豆蔻酰化位点，2
个内质网靶向序列，2个微体C-末端靶信号位点（图2）。

溶藻弧菌HY9901 VscH主要分布在细胞核（69.6%），其次为线粒体（21.7%），少量分布于细胞
骨架（8.7%）。

BLAST分析发现，溶藻弧菌VscH与其他物种有较高的同源性，其中与弧菌（Vibrio）的VscH氨基酸序列有99 %的同源性，用DNAMAN软件比对，发现弧菌中的VscH高度保守（图3）。

系统进化树表明，溶藻弧菌HY9901 VscH蛋白与弧菌（Vibrio）聚为一支（图4）。

预测结果表明，VscH二级结构有丰富的α-螺旋和β-折叠，且在α-螺旋和β-折叠之间存在丰富的转角，分别位于第4 ~ 7、20 ~ 23、25 ~ 28、37 ~ 40、48 ~ 51、89 ~ 92、109 ~ 112、116 ~ 119、131 ~ 134、140 ~ 143、154 ~ 157、204 ~ 207区段（图5a）。

这些转角结构较为松散，利于与抗体嵌合，具较高的
抗原表位可能性。

亲水性分析发现，VscH的主要亲水性区域位于第7 ~ 61、63 ~ 72、74 ~ 76、87 ~ 101、103 ~ 118、120 ~ 122和127 ~ 130、138 ~ 145、155 ~ 166、168 ~ 170、172 ~ 174、182 ~ 186、189 ~ 191、195 ~ 198、202 ~ 211区
段（图5b）。

蛋白质亲水性区域通常暴露于蛋白表面[19]，提示这些区段极可能
是抗原表位。

柔韧性预测表明，VscH蛋白柔性区域分布比较广泛，主要位于第5~7、14~43、48~59、69~73、77~85、90~96、106~120、123~128、130~134、
138~145、158~162、172~176区段（图5c）。

柔韧性大的区域较易发生扭曲，可促进与抗体的嵌合[19]，是成为抗原表位的可能区域。

抗原性指数结果显示，第4~9、14~45、47~62、69~77、88~98、105~119
和129~134、138~146、157~163、172~175、182~188、204~210区段的
抗原性指数较高（图 5d），说明这些区段为可能的抗原优势线性表位。

可及性预测发现，VscH有10个区域的表面可及性较大，分别是第13~43、
47~57、68~71、88~90、92~98、105~116、139~142、157~162和
172~174、204~206区段（图 5e）。

区域的表面可及性大说明其氨基酸残基有
较大的被溶剂分子接触的可能性，提示该区域可能成为VscH蛋白的优势抗原表面。

综合分析显示，VscH蛋白可满足以上全部指标要求的区段有5个，分别是第
20~23、25~28、37~40、48~51、109~112。

这5个区段不但有较高的亲水性、可及性和抗原性指数，且有利于成为抗原表位的转角和无规则卷曲，因此这些区域内或者附近极可能成为B细胞抗原优势表位。

预测结果表明，VscH有1个主要功能域，T3SS_needle_reg（71 - 211aa）(图6)。

VscH二级结构：α-螺旋占66.35%，无规则卷曲占23.22%，延伸链占
5.69%，β-折叠占4.74%（图7）。

用SWISS-MODEL 程序，通过自动搜索VscH氨基酸序列的同源蛋白作模板，构建VscH单亚基三级结构模型（图8）。

与其同源鼠疫菌（Yersinia pestis）毒力因子YopR的YscH单亚基有相似的构型（图8）。

本研究克隆得溶藻弧菌HY9901株外膜蛋白vscH基因全长序列，该基因编码的VscH氨基酸序列具有较高的保守性，与弧菌（Vibrio）相似性最高，为99%，与其他弧菌相似性大于69%，主要保守区位于C末端氨基酸，与鼠疫耶尔森菌[22-23]、小肠结肠炎耶尔森菌[24]研究结果一致，暗示溶藻弧菌vscH基因功能保守。

因此推测溶藻弧菌VscH蛋白可能是弧菌属的一种共同抗原，但需通过原核表达、免疫原性和免疫保护对其进行验证，为防治弧菌病找到新的有效共同抗原。

预测结果显示，VscH的三级结构与鼠疫耶尔森菌毒力因子YopR蛋白的编码基因yscH有相似构型，符合Ⅲ型输出蛋白YopR核心家族蛋白的典型结构。

在猪病毒候选蛋白[16]、TRPC6 蛋白[25]、以及HCVE2[26]等蛋白通过生物软件预测了B
细胞抗原表位，并根据所预测抗原表位成功制备良好亲和力的抗体，说明生物信息学方法预测到的抗原表位有助于制备更高效的亚单位疫苗[27]。

本研究通过预测发现，vscH基因的B细胞抗原表位可能在第20 ~ 23、25 ~ 28、37 ~ 40、48 ~ 51和109 ~ 112区段，预测到的vscH基因B细胞抗原表位，可能是抗体识别的重要位点，可为后续人工合成具良好亲和力的溶藻弧菌抗体提供参考。

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