发酵工艺学

第六章发酵过程中的通气和搅拌
葡萄糖在生物体内的有氧氧化
C6H12O6＋6O2→6H2O＋6CO2＋能量，1mol（180克）葡萄糖完全水解需要6mol（192克）氧，微生物只能利用溶解在水中的葡萄糖和氧，葡萄糖的溶解度70％（W/V）。

而一个大气压25度下，氧的溶解度
6.4mgO2/L，如生产中的需氧量按20－50mmolO2/L.H计算的话，培养液中的溶解氧只能维持微生物正常的生命活动20－50秒。

第一节发酵过程中氧的需求
一微生物对氧的需求
氧－细胞组成。

产物组成。

代谢所需元素。

好气微生物的最终电子受体。

通过氧化磷酸化为生物体提供能量
摄氧率：单位体积培养液每小时消耗的氧 mmol（O2）/L.h
呼吸强度：单位干菌体每小时消耗氧量mmol（O2）/g(干菌)。

在溶氧浓度低的情况下，呼吸强度随溶解氧的浓度的增加而增加，当溶解氧达到一定的值以后，呼吸强度就不再变化。

此时的溶解氧浓度称之为呼吸临界氧浓度。

C临界，在抗生素的发酵过程中，微生物生长阶段和产物代谢阶段的C是不同的。

多数品种的C长临>C合临
二氧在液体中的溶解特性
三影响微生物需氧量的因素
（一）微生物的种类和生长阶段菌体处于对数生长阶段的呼吸强度较高，生长阶段的摄氧率大于产物合成的摄氧率。

（二）培养基的组成一般来说，碳源浓度在一定范围内，需氧量随碳源浓度的增加而增加。

（三）培养液中溶解氧浓度C L的影响当培养液中的溶解氧浓度C L高于菌体的C长临时，菌体的呼吸就不受影响，如果C L低于C长临时，则代谢产生了变化。

（四）培养条件一般说来，温度越高，营养成分越丰富，其呼吸强度的临界值也增加
（五）二氧化碳的影响已知在相同条件下，二氧化碳在水中的溶解度是氧溶解度的30倍，所以要及时把二氧化碳排除罐内。

第二节氧在溶液中的传递
一氧传递的阻力在需氧发酵中，气态氧必须先溶解于培养液中，然后才能传递至细胞表面，再经过简单的扩散作用进入细胞内，参与菌体内
的氧化等生化反应。

二氧的传递方程式
第三节发酵液的流变学
微生物的发酵液是由三相体系组成，液相固相气相，在液相中有可溶性营养物质、盐类、代谢产物。

固相中包含菌丝体或菌丝团，不溶性的营养物质。

气相中包含无菌空气、二氧化碳。

一液流类型
二发酵液的流变学
第四节影响供氧的因素
一影响氧传递推动力的因素
1 提高饱和溶氧浓度的方法：降低培养温度、降低培养基的营养物质的含量、提高发酵罐内的氧分压。

空气通过装有吸附氮气的介质，减少氮含量，相对提高氧分压。

2 降低发酵液中的氧溶解浓度。

二影响液相体积氧传递系数的因素
1 搅拌效率的影响搅拌的作用：使发酵罐中的温度和营养物质均一，三相均衡。

把空气分割成小气泡，增加气液接触面积，强化发酵液的湍流程度，减少菌丝结团，尽快排除废气。

2 空气流速气泛现象：特定条件下，通入发酵罐内的空气流速达到一定的值时，使搅拌功率下降，当空气流速再增加时，搅拌功率不再增加，此时的空气流速称为气泛点。

3发酵液理化性质的影响
第7章发酵过程的控制
第1节微生物的发酵类型
投料方式：分批、补料、连续发酵
是否需氧：需氧、厌氧发酵
菌体生长与碳源消耗及产物合成之间的关系:生长、部分、非偶联
生长偶联型发酵：产物是直接源于产能的初级代谢，菌体生长、糖的分解代谢和产物形成几乎是平行的，因而菌体生长和产物形成期并不是分开的。

部分生长偶联：两个阶段（生长、合成）比较明显
非生长偶联：第一阶段菌体生长占主体，菌体生长速率和基质消耗速率基本同步，第二阶段以产物合成为主，只有少量的菌体产生和少量基质的消耗。

第2节发酵过程的工艺控制
一物理参数
1温度：全程不同阶段的温度
2压力：正压保持无菌，同时与氧、二氧化碳的溶解度有关。

0.02-0.05MPa
3 搅拌转速
4 搅拌功率kW/m3
5 空气流量指每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积。

一般控制在0.5-1.5v/v.min
6 粘度
二化学参数
1 PH
2 基质浓度（糖、氮、磷）
3 溶解氧浓度（mmol/l mg/l）
4 氧化还原电位
5 产物浓度
6 废气中氧二氧化碳的含量
三生物参数
1 菌体浓度
2 菌丝形态
第三节发酵过程中的代谢变化
一初级代谢产物发酵的代谢变化
初级代谢：生物细胞在生命活动中进行的与菌体的生长、繁殖相关的一类代谢活动。

基本特征：菌体进入发酵罐后经过生长、繁殖，并达到一定的浓度，出项延迟期、对数生长期、静止期、死亡期。

用静止期的菌种接种，既是能生长也会出现延迟期。

二次级代谢产物发酵的代谢变化
次级代谢：菌体生长与产物合成不是同步的，非偶联的发酵类型。

（一）菌体生长的阶段菌浓不断增加，摄氧率提高、溶氧浓度不断下降，PH变化：1 开始下降，然后上升，这是糖代谢先产生酮酸等有机酸而后被利用的结果。

2开始上升而后下降，这是由于菌体先利用培养基中氨基酸的碳骨架作为碳源而释放出氨，使PH上升，而后氨又被利用使PH下降的结果。

当营养物质消耗到一定阶段，菌体量达到一定足够量，菌体生长有关的酶活力下降，与次级代谢有关的酶活力开始出现。

（二）产物合成阶段主要代谢变化是以碳源、氮源的代谢和产物的合成代谢为主。

（三）菌体自溶阶段菌体衰老、细胞开始自溶、氨氮含量增加、PH 上升，产物合成能力下降，生产速率下降。

第四节菌体浓度的影响及其控制
一影响菌体生长的因素
细胞结构的复杂性、生长机制、营养物质、分裂时间、温度、PH、渗透压。

高浓度的营养基质形成高的渗透压，引起细胞脱水而抑制生长。

二菌浓对初级代谢的影响
一般发酵产物的产率和菌浓成正比，但是浓度过高，导致营养物质消耗过快，有毒物质积累，代谢途径发生变化，摄氧率增加、粘度增加、氧传递速率减少。

抗生素发酵要维持临界浓度，维持合适的生长速率，培养基要有合适的配比，然后在发酵中通过中间补料来控制。

当菌体生长缓慢、菌浓太低时，可以补加一部分氮源或磷酸盐以促进菌体生长，提高菌浓。

第5节营养基质的影响及其控制
一碳源的影响和控制
迅速利用的碳源：迅速参与代谢、合成菌体、产生能量，但是对次级代谢产生阻遏作用。

缓慢利用的碳源：被菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于抗生素分泌期的延长。

工业上，发酵培养基常采用含迅速和缓慢利用的混合碳源。

二氮源的影响和控制
氮源也有迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源，前者指氨基态的氮（氨基酸、硫酸铵、玉米浆。

后者指一些需要经过微生物胞外酶的消化才能释放出氨基酸或NH4＋的营养物质如：黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等。

速效氮源容易被菌体利用，但是对一些抗生素的合成有阻遏作用。

发酵培养基一般选用混合氮源。

生产上补加氮源：有机氮源－酵母粉、玉米浆、尿素无机氮源－氨水硫酸铵
三磷酸盐的影响和控制
菌体生长所需磷浓度比次级代谢所需磷浓度高的多。

磷酸盐浓度的控制主要是通过在基础培养基中采用适当的磷酸盐浓度。

抗生素一般采用生长亚适量（对菌体生长不是最合适但又不影响菌体生长的量）的磷浓度。

第6节温度的影响和控制
一温度对发酵的影响
温度的变化对发酵的影响：1 影响各种酶的反应速率和蛋白质的性质2影响发酵液的物理性质
二影响发酵温度变化的因素
产热：生物热搅拌热
散热：蒸发热辐射热显热
1 生物热营养基质被菌体分解代谢产生大量的热能，部分用于合成高能化合物，供给合成代谢所需要的能量，多余的热量则以热能的形式释放出来，形成生物热。

当菌体处于孢子发芽阶段和延迟期，产生的生物热有限，对数期，释放出大量的热能，并与细胞合成量成正比，对数期后开始下降。

2 搅拌热
3 蒸发热
4 辐射热
三温度的控制
1 最低温度的控制
在较低的通气条件下，由于氧的溶解度是随温度下降而升高的，因此降低发酵温度对发酵是有利的，因为低温可以提高氧的溶解度、降低菌体生长速率、减少氧的消耗，弥补通气效果差的不足。

四环素发酵在最后24小时，可以提高2－3度，提高发酵单位。

2 温度的控制循环冷冻盐水
第七节 PH的影响及其控制
一 PH对发酵的影响
适宜微生物生长的PH2.5-8.5，但是菌体里面的PH一般为中性。

一般认为细胞内的H＋和OH－离子能够影响酶蛋白的离解度和电荷状况，改变酶的结构和功能，引起酶活性的改变。

但是H＋和OH－离子不是直接作用在胞内酶蛋白上，而是首先作用在胞外的弱酸（或者弱碱）上，使之成为易于透过细胞膜的分子状态的弱酸（或弱碱），它们进入细胞后，再解离，产生H＋和OH－离子，改变胞内的状态，而影响酶的结构和活性。

PH还影响菌体对基质的利用速度和细胞的结构，以至影响菌体的生长和产物的合成。

二发酵PH的变化
PH变化的主要因素：菌种的遗传特性、培养基、培养条件。

三发酵PH的确定和控制
1 发酵的PH的确定
菌体生长的最适PH和产物合成的最适PH可能不一样。

将发酵培养基调
节乘不同的出发PH进行发酵，在发酵过程中，定时测定和调节PH。

以分别维持出发PH，，以菌体生长最大PH为菌体最适PH。

以同样的方法测定最合适合PH。

2 PH的控制
A：合理培养基的配方培养基中代谢产酸（葡萄糖产生酮酸、硫酸氨释放H＋）产碱（NaNO3尿素）以及缓冲剂（CaCO3）
B：补加生理酸性物质如硫酸氨或氨水。

发酵液PH和氨氮含量都低时，补加氨水，就可以达到调节PH和补充氨氮的目的。

反之PH较高，氨氮含量又低的时候，就补加硫酸氨。

补加消泡油的个别情况下，可以提高空气流量来加速脂肪酸的氧化，以纠正由于油脂分解产生大量脂肪酸引起的PH降低。

工业氨水20％，采用流加。

C：采用补料的方法实现补充营养、延长发酵周期、调节PH和改变培养液的性质。

第八节溶氧的影响及其控制
一溶氧对发酵的影响
维生素B12由薛氏丙酸菌发酵产生，Vb12组成部分咕啉醇酰胺（B因子）生物合成前期的两种主要酶受到养的阻遏，限制养的供给，才能积累B因子，B因子在供氧的情况下，才能转变成VB12。

特别：金霉素的发酵，在菌体生长期短时间停止通气，就影响菌体的糖代谢途径，由HMP途径转向EMP途径，使金霉素合成的产量减少。

金霉素C6上的氧直接来源于溶解氧。

二发酵过程的溶氧变化
发酵前期菌丝体大量繁殖，需氧量大于供氧，溶氧出现一个低峰。

在生长阶段，产物合成期，需氧量减少，溶氧稳定，但受补料、加油等条件大影响。

补糖后，摄氧率就会增加，引起溶氧浓度的下降，经过一段时间以后又逐步回升并接近原来的溶解氧浓度。

如继续补糖，又会继续下降，甚至引起生产受到限制。

发酵后期，由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度上升，一旦菌体自溶，溶氧浓度会明显上升。

发酵中溶氧异常下降的原因：1 污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗掉2菌体异常代谢3 设备或者工艺控制发生故障，搅拌速度明显下降、加消泡剂过多，引起溶氧下降。

发酵中溶氧异常上升的原因：菌体异常代谢，污染烈性噬菌体，菌体破裂后完全失去呼吸能力，溶氧就直接上升。

三溶氧浓度的控制
氧饱和度受温度、罐压、发酵液性质的影响。

发酵过程的需氧受到菌体
浓度、营养基质的种类浓度、培养条件等因素的影响。

保持最佳的菌体浓度，最适菌体浓度的控制可以通过营养基质浓度来控制。

还可以控制补料速度、调节发酵温度、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂。

第9节二氧化碳的影响及其控制
一：CO2对发酵的影响
发酵产生的CO2浓度对微生物生长和代谢具有次级或者抑制作用。

如芽孢杆菌等的发芽孢子开始生长时就需要CO2，但是对抗生素的发酵CO2一般是抑制作用，即使溶解氧在临界氧浓度上面，高浓度的CO2也是抑制作用。

二： CO2浓度的控制
CO2在发酵液中的影响因素：菌体的呼吸强度、发酵流变学特性、通气搅拌程度、外界压力。

逃液时入采用增加罐压的方法来消泡。

会增加CO2的溶解度，对菌体生长不利。

降低通气量和搅拌速率，有利于CO2在发酵液中的浓度，反之就会减少CO2的浓度。

补糖会增加排气中CO2浓度和降低PH
第10节补料分批发酵
一补料分批发酵的作用
FBC：分批培养过程中，间歇或者连续补加一种或者多种成分的新鲜料液的培养方法。

特点：1 解除了底物抑制、产物反馈抑制、分解产物阻遏。

2 可避免在分批发酵中，因一次投料过多引起的不良影响，降低发酵液粘度。

3 可以控制细胞质量，提高发芽孢子的比例
4 菌种退化变异的问题解决了
（一）可以控制抑制性底物的浓度
高浓度的基质可能发生抑制作用，使延滞期延长，比生长速率减小、菌浓下降等。

原因：1基质浓度高，渗透压高，细胞脱水而死亡2 高浓度基质能使微生物细胞热致死。

3 某些基质成分对关键的酶或细胞产生抑制作用4高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。

（二）可以解除或减弱分解产物阻遏
微生物合成初级或次级代谢产物中，有些合成酶受到易利用的碳源或者氮源的阻遏。

如葡萄糖分解代谢产物能阻遏赤霉素、青霉素的多种酶或产物的合成。

通过补料来限制基质的浓度。

可以解除易利用基质对酶及其产物合成的阻遏作用。

（三）可以使发酵过程最佳化
二补料的方式和控制（反馈控制和无反馈抑制）
第十一节泡沫的影响及其控制
由于培养基中蛋白类表面活性剂的存在，通气情况下，培养液中出现泡沫，泡沫是气体分散在液体中的胶体体系，气液被液膜隔开。

发酵液表面的泡沫－机械性泡沫、发酵液中均匀分布的泡沫－流态泡沫。

起泡沫的方式：
1整个过程泡沫恒定
2发酵早期起泡后稳定的下降、以后保持恒定
3发酵前期泡沫稍微降低后又回升
4发酵开始起泡能力低、以后上升
5综合以上
发酵中泡沫的影响：装料系数下降、氧传递系数减小、逃液、染菌、呼吸受阻、代谢异常、菌体自溶。

消泡的方法：
1 调整培养基的成分和改变发酵的条件
2 消除已有的泡沫
1．1机械消泡
1．2消沫剂消泡表面活性剂，具有较低的表面张力。

如聚氧乙烯氧丙稀甘油（GPE泡敌），理想的消泡剂：亲水性、低浓度消泡、持久消泡、不影响氧传递和产物提取、对微生物和人动物无毒、成本低。

GPE 和矿物油、植物油混用、以及消泡剂之间的混用、加乳化剂都可以GPE 增效。

第十二节发酵终点的确定
单位时间单位罐体积所积累的产物量g/L.h
1经济因素最大限度降低成本、最大产量、最短时间。

2产品质量
3特殊因素产量、过滤速度、氨基氮含量、菌丝形态、PH、发酵液外观、粘度。