制药工程专业实验

制药工程专业实验
制药工程专业实验为制药工程专业的核心课程之一，它改革了原来各专业课单独开设实验课的方式，将基本操作实验技术、化学合成药物制备、生物药物制备、工业制剂等实验内容有机地结合形成综合性的制药工程专业实验。

通过本课程的教学，使学生加深巩固对工业制剂、药物及中间体合成制备及质量控制的专业知识，理论联系实际，同时在有机化学实验的基础上，提高药物及中间体合成制备的实验技能。

培养分析和解决实际问题的能力，为毕业论文及将来的工作打下一定的实验基础，成为掌握一定实验技能的专业技术人才。

本课程面对制药工程专业四年级学生，总学时为64学时，4学分。

实验一快速柱色谱
从混合物中分离出单一的化合物，至今仍然是化学工作者的基本任务之一。

在开始对某种物质从化学的角度进行考察之前，通常首先需要获得足够量的纯物质。

有许多分析方法在进行实际分析之前，同样首先要求把各个组分从试样中分离出来。

自然界中的许多物质，主要以混合物的形式存在；例如，我国的中草药，每味药内大多含有多种成分；合成产品和许多化学反应的产物通常也不尽是单一的物质，反应过程中除主要反应外还常伴随着副反应，甚至有的原料可能就是一种混合物，得到的产物非常复杂；而科学研究和工业生产大多要求从天然或合成产物中分离出纯物质；因此，化学工作者最经常进行的工作之一，就是把复杂的混合物分离成各个单一的纯物质。

有关分离的历史已很悠久，分离方法也较多，如沉降、澄清、沉淀、过滤、萃取、升华、重结晶、蒸发、蒸馏、精馏和色谱等。

但对于结构与性质十分相似的各组分的分离，大多数分离方法是无能为力的，而色谱法则是非常有效的分离方法。

色谱法又分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、气相色谱、液相色谱、薄层色谱和柱色谱等。

这里对常用的快速硅胶柱色谱的实验方法与技巧进行讲解。

一、实验目的要求
1、熟悉色谱的基本原理。

2、掌握快速柱色谱的基本操作与技巧。

二、实验原理
色谱（又称层析）是一种物理的分离方法。

它的分离原理是使混合物中各组分在两相间进行分配，其中一相是不动的，称为固定相，另一相是携带混合物流过此固定相的流体，称为流动相。

当流动相中所含混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用。

由于各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小、强弱也有差异，因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。

这种借助在两相间分配差异而使混合物中各组分分离的技术，称为色谱法。

（一）薄层色谱
薄层色谱（TLC）是一种简单实用的实验技术，属固液层析。

一般薄层色谱的固定相是硅胶或氧化铝，属吸附层析。

在层析过程中，吸附
剂对样品中各组分的吸附力不同，当展开剂流过时，各组分被展开剂从吸附剂上解析下来的难易程度不同，从而造成各组分移动时的速度差别，而达到分离的目的。

薄层色谱可以用来分离混合物、鉴定精制化合物、测量混合物中各组分的含量、测定样品纯度。

其展开时间短，几十分钟就能达到分离目的，分离效率高，还可用制备板分离几毫克到几百毫克的样品。

在药物合成实验中，还常用来跟踪反应进程和确定反应的终点。

薄层色谱特别适用于挥发性小的化合物以及在高温下化学性质不稳定的化合物的分析。

（二）柱层析色谱
柱层析色谱是通过层析柱来实现分离的，主要用于大量化合物的分离。

层析柱内装有固体吸附剂，也就是固定相，如氧化铝或硅胶等。

液体样品从柱顶加入，在柱的顶部被吸附剂吸附，然后从柱的顶部加入有机溶剂也就是展开剂进行洗脱。

由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，各组分以不同速度下移，被吸附较弱的组分在流动相里的含量较高，以较快的速度下移。

各组分随溶剂按一定顺序从层析柱下端流处，分段收集流出液，再用薄层色谱来鉴定各组分。

柱层析的分离条件可以套用该样品的薄层色谱条件，分离效果亦相同。

快速柱色谱是1978年Still等提出将快速柱色技术用于有机化合物的分离制备。

它具备以下特点。

（1）设备简单，操作容易，流动相由低压（0.05-0.8Mpa）压缩
空气或氮气驱动。

（2）可与薄层色谱配合使用，通过薄层色谱寻找合适的展开剂，作为快速色谱的冲洗剂。

（3）用硅胶或键合硅胶装短柱，一般高于7-15cm，具有中等分离度。

在薄层上∆R f≥值0.10-0.15的组分，在快速色谱柱上都可以很好地分开。

（4）色谱柱的材料多为玻璃或石英，易于观察洗脱状态。

三、实验方法
（一）装柱在色谱柱（直径5cm,长50cm）中，湿法装入150mL硅胶。

（二）加样0.1g邻硝基苯胺与0.1g对硝基苯胺用2mL乙酸乙酯溶解。

（三）冲洗冲洗液：石油醚/乙酸乙酯=6：1。

（四）收集产品先洗出的为邻硝基苯胺，后洗出的为对硝基苯胺。

思考题：
影响快速柱色谱分离效果的主要因素有哪些?
实验二丙二酸亚异丙酯的合成
丙二酸亚异丙酯，亦称Meldrum’s acid, 因其制备简便，含有活性亚甲基和在温和条件下易水解的酯基，在有机合成中是具有多种反应性能的反应中间体。

一、实验目的要求
1、学习一种丙二酸酯的简便合成方法。

二、实验原理
三、实验方法
在50mL园底烧瓶中，加入12mL（0.12mol）醋酸酐，称取10.4g（0.10mol）粉末溶于醋酸酐中（溶解不完），在冰水冷却和搅拌下加入0.4mL的浓硫酸，20分钟后滴加8mL（0.11mol）丙酮，继续在20-25O C下反应4h,并不时搅拌或振荡反应混合物。

反应混合物置于冰箱中过夜结晶。

实验三丙二酸亚异丙酯的精制
丙二酸亚异丙酯，亦称Meldrum’s acid, 因其制备简便，含有活性亚甲基和在温和条件下易水解的酯基，在有机合成中是具有多种反应性能的反应中间体。

一、实验目的要求
1、掌握结晶纯化、熔点测定等操作。

二、实验原理
三、实验方法
抽滤产生的固体，并用水洗涤，得到的粗产品分成两份，一份用30％的丙酮－水重结晶，另一份用水重结晶，计算收率，用显微熔点仪测定熔点（文献值94－95O C）。

思考题：
试述结晶纯化的操作要点。

实验四L-抗坏血酸钙的制备
L-抗坏血酸又名维生素C ，是广泛存在于动植物体内的一种有机物质，是人体内必需的营养成分。

该分子具有烯醇式结构，使它不仅作为营养强化剂应用于食品、医药工业，而且作为抗氧剂获得了广泛的应用。

但由于其易于氧化变质的特点，使用效果不太理想。

而它的钙盐（简称VC-Ca）则克服了这个缺点，实验证明，它不仅比VC稳定，而且吸收效果好，在体内具有VC的全部作用，其抗氧化作用优于VC，且由于Ca的引入，也增强了它的营养强化作用。

L-抗坏血酸钙早在1964年由美国人Ruskin研制成功，不久后该产品便在美国、瑞士、日本等国上市，随着研究的深入，用途不断发展，研究表明它还可作为保鲜剂、杀菌剂，作为钙盐可预防骨质疏松，用于茶及饮料中可降血压。

该产品需要量有日益扩大的趋势，目前，VC-Ca在国外如瑞士罗士，日本武田等都在大量生产；在国内，东北制药厂已有大批量生产，湖北宜昌制药厂已形成了年产1000吨的生产能力。

一、实验目的要求
1、了解L-抗坏血酸的基本化学性质。

2、掌握L-抗坏血酸钙制备的基本方法。

二、实验原理
三、实验方法
在100mL反应器中，加入5.4g(0.03mol) L-抗坏血酸,10mL水，加热（50 O C）溶解,于剧烈搅拌下缓慢加入 1.5g(0.015mol)碳酸钙粉末,待无气泡逸出时停止搅拌。

反应物在室温下难于自行结晶，用无水乙醇或丙酮沉淀，抽滤，真空干燥得产品。

思考题：
L-抗坏血酸还可以生成哪些为生理正常发育所需要的金属盐？
实验五N-苄基乙酰苯胺的合成（一）
一、实验目的要求
1、掌握酰胺的制备方法。

2、了解胺基的N-烷基化方法，以及相转移催化剂在有机合成中的应用。

二、实验原理
N-苄基乙酰苯胺为重要的医药中间体，其合成分为两步。

先合成乙酰苯胺，
存在下反应,生成N-苄基乙酰苯然后乙酰苯胺与苄氯在相转移催化剂和NaHCO
3
胺。

具体反应式如下：
三、实验方法
乙酰苯胺的合成：
在250mL烧杯中加入5mL（5.1g,0.055mol）苯胺，再加入25mL水，搅拌下分批加入6.3mL醋酸酐，反应液冷却后减压抽滤，并用少量冷水洗涤产物。

将抽滤出的粗乙酰苯胺在250mL烧杯中用水重结晶，干燥得精品乙酰苯胺。

用显微熔点仪测定熔点（115-116O C）。

思考题：乙酰苯胺的常用合成方法有哪些？
实验六N-苄基乙酰苯胺的合成（二）
一、实验目的要求
1、掌握酰胺的制备方法。

2、了解胺基的N-烷基化方法，以及相转移催化剂在有机合成中的应用。

二、实验原理
N-苄基乙酰苯胺为重要的医药中间体，其合成分为两步。

先合成乙酰苯胺，然后乙酰苯胺与苄氯在相转移催化剂和NaHCO
存在下反应,生成N-苄基乙酰苯胺。

3
具体反应式如下：
三、实验方法
N-苄基乙酰苯胺的合成：
在50mL梨形烧瓶中加入10mL甲苯，2.7g乙酰苯胺，0.6g四丁基溴化铵，2.5mL 氯化苄，10mL30%氢氧化钠水溶液，剧烈搅拌，加热回流6小时，冷后，水洗，旋干得淡黄色油状产物。

思考题：
本实验中为何要使用四丁基溴化铵，其作用是什么？
实验七L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的制备
一、实验目的要求
1、了解手性源不对称合成氨基酸酯化的一种方法。

2、了解二氯亚砜在酸酯化中的应用。

二、实验原理
三、实验方法
在50mL梨形烧瓶中加入2.0g L-苯丙氨酸、20mL无水甲醇，在冷水冷却搅拌下慢慢滴加3mL二氯亚砜，室温搅拌反应6小时，50O C旋干得白色固体产物。

用显微熔点仪测定熔点。

思考题：
形成酯的反应中可否用对甲苯磺酸作催化剂，操作条件有何不同？
实验八藜芦酸的制备工艺及过程监控（一）
一、实验目的要求
1、掌握醚的制备方法。

2、掌握氧化反应的基本方法。

3、熟悉用薄层色谱方法监测反应过程的方法。

二、实验原理
三、实验方法
藜芦醛的合成：
在50mL梨形烧瓶中加入30mL丙酮、5.0g香兰素、2mL碘甲烷、2.5g无水碳酸钾，室温搅拌反应，每隔2小时用薄层色谱监测反应情况，当反应基本完成后，抽滤，滤饼用2 X 10mL丙酮洗涤，滤洗液旋干，剩余物加20mL乙酸乙酯溶解，依此用饱和碳酸钠水溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，80O C旋干得白色固体产物。

用显微熔点仪测定熔点。

思考题：
藜芦醛的合成还可以用哪些方法？
实验九藜芦酸的制备工艺及过程监控（二）
一、实验目的要求
1、掌握醚的制备方法。

2、掌握氧化反应的基本方法。

3、熟悉用薄层色谱方法监测反应过程的方法。

二、实验原理
三、实验方法
藜芦酸的合成：
在250mL三颈烧瓶中加入10mL水，
5.0g香兰素、2mL碘甲烷、2.5g无水碳酸钾，室温搅拌反应，每隔2小时用薄层色谱监测反应情况，当反应基本完成后，抽滤，滤饼用2 X 10mL丙酮洗涤，滤洗液旋干，剩余物加20mL乙酸乙酯溶解，依此用饱和碳酸钠水溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，80O C旋干得白色固体产物。

用显微熔点仪测定熔点。

实验十γ-苯基-γ-氧代-α-丁烯酸的合成
一、实验目的
1、掌握芳环酰基化的方法。

2、了解Fried-Crafts反应（傅-克酰化反应）的常规操作；
3、了解不同Fried-Crafts反应中催化剂的用量比例。

二、实验原理
γ-苯基-γ-氧代-α-丁烯酸是几个普利类抗高血压药物的重要中间体，其合成主要为苯与顺丁烯二酸酐在AlCl3催化剂的作用下进行傅-克酰化反应，具体反应
式为：
三、实验步骤
，1.0g顺丁烯二在50mL的三口烧瓶中加入10mL干燥的苯，2.1g无水AlCl
3
酸酐，在90-1000C，搅拌反应1h．冷却至室温，加入3mL水，搅拌30分钟,加入10mL2mol/L盐酸，搅拌15分钟，冷却，抽滤，水洗至中性，真空干燥，得粗产物，约1.6g。

四、注意事项
1、该反应是酸酐与苯之间的傅-克酰化反应，因此催化剂的用量至少应为酸酐的
1.5当量。

思考题
1、傅-克酰化反应有几种类型，每种类型反应中催化剂的用量如何？
2、为什么要加入2mol/ L盐酸到反应体系中，其作用是什么？
参考值
4-苯基-4-氧代-2-丁烯酸的熔点为61-630C。

实验十一 4-氨基-1，2，4-三唑-5-酮的制备（一）
一、实验目的
1、掌握三唑类化合物的制备方法。

2、了解三唑类化合物的理化性质。

3、了解关环反应的制备方法。

二、实验原理
三唑类杀菌剂是杀菌剂发展史上最引人注目的一类新型杀菌剂，此类杀菌剂为含氮的五元杂环化合物，S.Schulze等研究发现某些三唑类衍生物具有抑制植物病毒的活性，对麦角甾醇生物合成的某些过程有着不同的抑制作用。

4-氨基-1，2，4-三唑-5-酮（ATO）是一种白色粉末状固体，熔点为1870C，具有含氮量高，结构致密等特点。

它可用作杀菌剂及中间体。

也可以用作制备高能炸药的中间体。

1964年．Kroeger等人首次提出利用碳酰肼关环制备4-氨基-1，2，4-三唑-5-酮（ATO）。

美国科学工作者Odenthal等人利用碳酰肼与结构不同的腈反应制得了带有不同取代基的三唑酮，具体反应方程为：
原甲酸三乙酯是一种原碳酸的衍生物，可利用原甲酸三乙酯使碳酰肼发生关环反应制备ATO，由于原甲酸三乙酯的中心碳原子受三个乙氧基的吸电子作用，使其带有部分正电荷，当受亲核实际碳酰肼分子中带负电荷较多的端基氮原子进攻时，发生亲核取代反应。

首先发生亲核加成，再发生消除反应，脱去一个乙醇分子，进而生成一种缩酮四面体中间体；然后，由羰基邻位氮原子进攻缩酮碳，又脱去一个乙醇分子，生成化合物ATO。

三、实验步骤
1、ATO的合成采用装有温度计、回流冷凝管和搅拌器的三口烧瓶做反应瓶，
称取精制过的碳酰肼9g，量取18ml原甲酸三乙酯和2ml蒸馏水一次加入到反应器中。

控制反应温度在65-850C，保持回流反应3h。

然后，改为馏装置，蒸出反应体系中的副产物乙醇和水。

反应时到后，搅拌降温，冷却至室温过程中析出粉红色固体，出料，抽滤，烘干后备用。

四、注意事项
实验中反应温度最好控制在76-780C，反应时间应该控制在3-3.5h为宜。

实验十二 4-氨基-1，2，4-三唑-5-酮的制备（二）
一、实验目的
1、掌握三唑类化合物的制备方法。

2、了解三唑类化合物的理化性质。

3、了解关环反应的制备方法。

二、实验原理
三唑类杀菌剂是杀菌剂发展史上最引人注目的一类新型杀菌剂，此类杀菌剂为含氮的五元杂环化合物，S.Schulze等研究发现某些三唑类衍生物具有抑制植物病毒的活性，对麦角甾醇生物合成的某些过程有着不同的抑制作用。

4-氨基-1，2，4-三唑-5-酮（ATO）是一种白色粉末状固体，熔点为1870C，具有含氮量高，结构致密等特点。

它可用作杀菌剂及中间体。

也可以用作制备高能炸药的中间体。

1964年．Kroeger等人首次提出利用碳酰肼关环制备4-氨基-1，2，4-三唑-5-酮（ATO）。

美国科学工作者Odenthal等人利用碳酰肼与结构不同的腈反应制得了带有不同取代基的三唑酮，具体反应方程为：
原甲酸三乙酯是一种原碳酸的衍生物，可利用原甲酸三乙酯使碳酰肼发生关环反应制备ATO，由于原甲酸三乙酯的中心碳原子受三个乙氧基的吸电子作用，使其带有部分正电荷，当受亲核实际碳酰肼分子中带负电荷较多的端基氮原子进攻时，发生亲核取代反应。

首先发生亲核加成，再发生消除反应，脱去一个乙醇分子，进而生成一种缩酮四面体中间体；然后，由羰基邻位氮原子进攻缩酮碳，又脱去一个乙醇分子，生成化合物ATO。

三、实验步骤
1、ATO的精制先用少量蒸馏水将ATO粗品溶解后，再加入2倍量的95%乙醇，加热至回流，趁热抽滤，冷却后得到白色细颗粒晶体。

2、ATO晶体熔点的测定取少量的ATO晶体，干燥。

然后按照X-4数显显
微熔点测定仪的操作规程进行熔点的测定，多次测定，取平均值。

实验十三芦丁的提取和鉴定
计划学时：6学时
一、目的要求
1.掌握从天然产物中提取黄酮苷的原理和方法。

2.掌握色谱分析的原理和方法及黄酮苷的纸色谱检验的具体操作。

3.掌握抽滤、热抽滤及重结晶操作。

二、实验原理
芦丁是黄酮苷类物质，广泛存在于植物中，其中槐花米中的含量高达12～16％。

本实验利用芦丁易溶于碱性水溶液呈黄色，酸化后又析出的性质进行提取，并利用它在冷水中和热水中溶解度相差较大的特性进行重结晶纯化。

芦丁是糖苷类化合物，其糖苷键在酸性条件下可水解产生槲皮素，属于黄酮类化合物，天然黄酮类化合物及其苷类的混合物鉴定常用双向色谱。

三、实验步骤
（1）提取
①取10g槐花米研碎，置于250ml烧杯中，加6倍水，煮沸，加石灰乳调pH＝8～9。

②微沸20～30min，趁热抽滤，残渣再加4倍水同上法再煮一次，趁热抽滤。

③合并滤液在60～70℃下用浓HCl调pH＝4～5，使沉淀完全，抽滤，洗涤，60℃干燥得粗芦丁。

（2）精制
①粗芦丁加水煮沸、趁热抽滤，静置冷却，析出芦丁结晶、抽滤、洗涤。

②70～80℃烘干，称重，得芦丁精品。

（3）纸色谱检验
①样品：自制质量分数为1％的芦丁乙醇溶液和1％槲皮素乙醇溶液。

对照品：质量分数为1％的槲皮素标准品与1％芦丁标准品乙醇溶液。

②展开剂：（1）正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5）；
（2）质量分数为15％的醋酸水溶液。

③显色剂：喷三氯化铝试剂呈黄色斑点。

思考题：
黄酮类化合物还有那些提取方法？
对比两种提取方法的优缺点？
如果得率不高，分析原因？
实验十四大枣多糖的提取
实验学时：6学时
一、实验目的：
学习多糖的提取分离方法及工艺
熟悉萃取、离心、蒸发、干燥等单元操作
掌握苯酚－硫酸法鉴定多糖的方法
二、实验原理：
多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。

早在60年代，人们就发现多糖复杂的生物活性和功能。

它可以调节免疫功能，促进蛋白质和核酸的生物合成，调节细胞的生长，提高生物体的免疫力，具有抗肿瘤、抗疡和抗爱滋病(AIDS)等功效。

多糖组分主要存在于其形成的小纤维网状结构交织的基质中，利用多糖溶于水而不溶于醇等有机溶剂的特点，通常采用热水浸提后用酒精沉淀的方法，对多糖进行提取。

影响多糖提取率的因素很多，如：浸提温度、时间、加水量以及脱除杂质的方法等都会影响多糖的得率。

多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。

一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。

常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。

本实验采用Sevag法(氯仿：正丁醇＝4：1混合摇匀)进行脱蛋白，用DEAE Sepharose层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，得多糖级分。

三、试剂和器材
1、试剂
平衡缓冲溶液：0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2。

洗脱液：A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2。

氯仿、正丁醇、乙醇(95％)等，均为分析纯。

2、材料
大枣。

3、器材
DEAE Sepharose Fast Flow，旋转真空蒸发仪，摇床，离心机，层析柱：26×10。

四、操作方法
1、粗多糖的提取
将多糖实体切碎烘干后称量，采用热水浸提法，每次原料和水之比均为1：5，浸提温度为70℃－80℃，浸提时间3－5h，共提取4次，合并4次浸提液。

真空旋转蒸发浓缩，浓缩一倍体积。

对多糖提取液需进行脱色处理，即以1％的比例加入活性炭，搅拌均匀15min后过滤即可。

在浓缩液中加入3倍体积的乙醇搅拌，沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗多糖。

它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐，必须进一步分离纯化。

2、粗多糖的纯化
粗多糖溶液加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝3：1混合摇匀)后，置恒温振荡器中震荡过夜，使蛋白质充分沉淀，离心(3000r／min)分离，去除蛋白质。

然后浓缩，透析，加入4倍体积的乙醇沉淀多糖，将沉淀冻干。

取样品0.1g溶于10ml 0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2的平衡缓冲液中。

上样，用Buffer A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; Buffer B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2 进行线性洗脱，分部收集。

各管用硫酸苯酚法检测多糖。

合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，即得多糖级分。

思考题：
1、影响多糖提取的因素有那些？
2、溶液颜色与多糖含量的关系？
实验十五胰蛋白酶的制备及活力的测定
实验学时：8学时
一、目的要求
（1）学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。

（2）了解酶的活性与比活性的概念。

二、实验原理
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。

Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。

重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。

最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。

此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。

胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。

因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。

目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。

用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰
-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。

本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。

酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。

从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。

经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。

收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。

一般经过2～3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到8000～10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。

如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。

三、试剂和器材
1、试剂
pH2.5乙酸酸化水；2.5mol/L H2SO4；5 mol/L NaOH；2 mol/L NaOH；2mol/L HCl；0.001M HCl；硫酸铵；氯化钙。

0.8 mol/L pH9.0硼酸缓冲液：取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。

0.4 mol/L pH9.0硼酸缓冲液（用0.8 mol/L稀释1倍即可）；
0.2 mol/L pH8.0硼酸缓冲液：取70ml 0.2 mol/L硼酸溶液，加30ml 0.5 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计校正。

0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液：取50mL 0.1 mol/LTris加29.2 mL mol/L HCl 加水定容至100mL。

底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液中加0.34毫克BAEE和2.22毫克的氯化钙。

2、材料
新鲜或冰冻猪胰脏
3、仪器
食品加工机和高速分散器；研钵；大玻璃漏斗；布氏漏斗；抽滤瓶；纱布；恒温水浴；紫外分光光度计；秒表；pH试纸。

四、操作方法
1、猪胰蛋白酶制备
（一）猪胰蛋白酶原的提取
猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。

加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱
布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升）。

加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过
夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。

（二）胰蛋白酶原激活
向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶
解，得胰蛋白酶原溶液。

将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使Ca2+与SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中最终仍含有0.1M CaCl2。

a．用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活。