蜂王浆特有成分10-hda的研究进展

收稿日期：2019-10-15
作者简介：缪卓宁，浙江大学动物科学学院动物科学1702班本科生指导教师：胡福良，教授，博导，E-mail:flhu@
摘要:10-羟基-△2-癸烯酸（10-HDA ）是蜂王浆特有的高效生物活性物质，占鲜蜂王浆的1.4%～2.0%。

对10-HDA 的来源、结构、生物学活性、测定方法和提取方法等进行了综述，对其开发利用前景进行了展望。

关键词：10-HDA ；结构；生物学活性；
含量测定；提取
中图分类号：S896.3
文献标识码：A
文章编号：1003-9139（2020）02-0004-06
Research Progress in the Unique
Component 10-HDA in Royal Jelly
MIAO Zhuo-ning,HU Fu-liang
(College of Animal Sciences,Zhejiang University,
Hangzhou 310058,China)
Abstract ：10-hydroxy-△2-dece-noic acid
(10-HDA)is a highly effective bioactive substance u nique to royal jelly,accounting for approximately 1.4%to 2.0%in fresh royal jelly.In this article,the origination,
structure,
biological
activity
and
methods for determination and extraction of 10-HDA was summarized,and the development and utilization prospects was prospected.
Key words:10-HDA;
structure;
biological
activity;content determination;extraction
1引言
10-羟基-△2-癸烯酸（10-hydroxy-△2-dece-noic acid ，10-HDA ）是蜂王浆特有的脂肪酸，俗称王浆酸，是蜂王浆的标志物。

人们对10-HDA 的研究,可以追溯到20世纪40年代甚至更早。

Townsend 和Luas(1940)全
面分析了蜂王浆的理化性质[1]。

有趣的是，在用乙醚提取的过程中，他们发现了一种脂肪酸。

经过一系列有机化学分析测试后，排除了内酯或内酯酐的可能,并得到脂肪酸的分子式为C 10H 18O 3,奇怪的是，他们发现碳链上不存在不饱和键。

关于这种脂肪酸的具体结构的困惑持续了将近20年,直到Butenandt (1957)首次从蜂王浆中分离出这一脂肪酸，并且，他通过红外光谱方法首次确定了其结构为10-羟基-2-癸烯酸[2]，随后Barker(1959)等经核磁共振确认其为反式异构体[3]。

随后在Brown 和Frere(1959)等人的进一步努力下,通过辐照生成空间异构体才最终确定双键两侧基团呈反式排列(图1)。

它之所以被称为王浆酸，是因为其独一无二的结构，至今为止只在蜂王浆中发现，使之当之无愧成为了蜂王浆的代表物质。

10-HDA 的发现和确认引发了国内外学术界对蜂王浆中脂肪酸的探究热潮，从结构、性质、生理活性及其含量的测定方法等方面对10-HDA 进行了深入的研究。

210-HDA 生理活性的研究
10-HDA 具有十分广泛的生物学活性，主要表现在以下几个方面。

2.1抗菌活性
10-HDA 被认为是一种特别强的抗菌剂，
●课程论文园地
蜂王浆特有成分10-HDA 的研究进展
缪卓宁，胡福良
（浙江大学动物科学学院，浙江杭州310058）
图110-HDA 结构示意
图
Alreshoodi(2015)等人的研究表明10-HDA对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和大肠杆菌枯草芽孢杆菌抑菌效果极强[4]。

除此之外，Yousefi (2012)等人发现该脂肪酸通过干扰葡糖基转移酶gtfB和gtfC的表达来干扰口腔病原体变形链球菌对细胞表面的粘附[5]。

与此同时，Melliou(2005)等人的结果也表明10-HDA对热带念珠菌和白色念珠菌等真菌有良好的抗菌活性[6]。

2.2抗炎活性
在Fang(1994)等人的一项关于蜂王浆可能导致消化系统疾病的研究中他们发现10-HDA 可以保护大鼠免受实验性胃溃疡的伤害[7]。

此外，Sugiyama(2012)等人在鼠巨噬细胞RAW264细胞系的研究中表明，10-HDA是通过抑制LPS诱导的NF-kB信号通路的活化来发挥其抗炎症活性[8]。

随后，陈伊凡(2018)等人的结果从体内和体外的角度验证其抗炎活性，10-HDA对炎症介质和NO的主要释放的抑制作用是有效的，并存在剂量依赖性。

并且IL-1β，IL-6，MCP-1和COX-2等几种关键炎症基因也被10-HDA抑制[9]。

另有Wang (2015)等人的研究显示类风湿性关节炎患者的成纤维样滑膜细胞具有10-HDA抑制作用，这也证明了其对慢性炎症退行性疾病的治疗潜力[10]。

2.3免疫调节活性
目前已经报道了10-HDA的各种免疫调节活性，包括10-HDA通过抑制活化T细胞的IL-2Rα的表达和IL-2的产生达到抑制异种T细胞的增殖的效果[11]。

除此之外，石晶(1990)等人发现10-HDA(50，100mg／L)能提高巨噬细胞的吞噬活性，一定量的提高免疫系统活性[12]。

与此同时，Gasic(2007)和Sugiyama(2013)等人的研究结果表明10-HDA能抑制脾树突状细胞产生白介素12以及抑制巨噬细胞中LPS和IFN-β诱导的NO产生[13-14]。

在另一项研究中，Mihajlovic (2013)等人发现10-HDA在人单核细胞衍生的树突状细胞上具有双相行为，导致Th1反应刺激和Th2在50μM下调，并在500μM抑制Th1和Th2[15]。

2.4抗衰老活性
Honda(2015)等人发现10-HDA可能通过饮食限制和TOR激酶信号传导来延长线虫的寿命并赋予其耐热和氧化应激耐受性[16]。

Koy-a-Miyata(2004)和Park(2011)等人的研究表明10-HDA促进人皮肤成纤维细胞中增加胶原蛋白的合成和胶原蛋白促进因子（转化生长因子β1）的产生，这种作用介导了蜂王浆皮肤对UVB诱导的光老化的保护作用[17-18]。

除了促进胶原蛋白合成外，Yang(2010)和Wang(2012)等人还发现10-HDA可能通过下调涉及JNK/ p38MAP激酶和AP-1转录因子的途径来抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞释放MMP-1和MMP-3[19]和MMP调节剂结缔组织生长因子[20]。

并且，Zheng(2013)等人发现10-HDA还抑制了成纤维细胞中UVA诱导的JNK/p38活化以及MMP-1和MMP-3的上调[21]。

2.5抗肿瘤活性
Izuta(2009)等人实验表明10-HDA促进具有抗癌活性和免疫调节作用的白细胞介素2和淋巴细胞亚群的生长[22]。

除此之外，Peng-panich和Srisuparbh(2019)发现10-HDA不仅降低了三恶性乳腺癌细胞（TNBC）的细胞存活率，而且10-HDA处理细胞后，显著抑制TNBC的侵袭、粘附和释放，对侵袭性乳腺癌细胞具有抗转移活性[23]。

2.6抗辐射活性
Zheng(2012)等人的研究表明了10-HDA对紫外线（UV）A诱导的人皮肤成纤维细胞（HDFs）的保护作用。

10-HDA通过抑制紫外线A诱导产生细胞毒性和活性氧(ROS)，和刺激胶原蛋白生成，来达到保护HDF的目的。

此外，10-HDA在转录和蛋白质水平上均抑制UVA诱导的MMP-1和MMP-3表达。

10-HDA处理还减少了UVA诱导的JNK和p38MAPK途径的激活[24]。

另有Park(2011)等人的研究表明，10-HDA可与蜂王浆中其他脂肪酸组分发生协同作用，通过刺激UVB诱导的NHDF中TGF-β1的产生来上调I型胶原蛋白的水平[25]。

2.7降血糖活性
Xu(2002)等人已发现该脂肪酸可改善大鼠
模型的高脂血症状况[26]。

此外，Takikawa(2013)等人的针对L6肌管的体外研究以及针对小鼠的体内研究均表明10-HDA通过AMP激活的蛋白激酶活化和GLUT4转运至质膜来增强胰岛素非依赖性肌肉葡萄糖摄取[27]。

2.8神经调节活性
Terada(2011)等人证明10-HDA和10-羟基-2-癸烯酸是人类TRPA1和TRPV1受体的有效激动剂[28]。

此外，Hattori(2007)等人的研究表明10-HDA刺激了大鼠胚胎神经干细胞的神经元分化，可能起着ω-3二十二碳六烯酸的作用。

ω-3二十二碳六烯酸是一种必需的饮食成分，已知会促进中枢神经系统的神经发生。

二十二碳六烯酸被认为对大脑发育和功能必不可少，并且已在大鼠帕金森氏模型中显示出积极作用，这表明10-HDA的潜力相似，此外，由于10-HDA是较小的分子，它还可以更容易地穿过血脑屏障[29]。

Hirakawa (2010)等人的关于合成中链脂肪酸的研究也表明了蜂王浆脂肪酸的神经生成潜能，其中2-癸烯酸乙酯（10-HDA的衍生物）促进了大鼠模型的功能恢复[30]。

另有Pyrzanowska (2012)等人的研究显示，10-HDA增加神经元的生成[31]。

310-HDA含量测定方法
鉴于10-HDA作为蜂王浆的化学指标已被普遍接受，测定10-HDA含量的方法已有很多种。

随着色谱法以及其他相关技术的发展，分光光度法和色谱法等原始测定方法得到不断的改进与优化。

与此同时，新测定方法如雨后春笋般层出不穷，如ELISA 法等。

3.1分光光度法
目前对分光光度计的研究集中在最佳波长的选择和样品前处理的改进上。

赵静(1998)研究表明，使用三波长紫外光谱法来测定10-HDA的含量，可减轻干扰因子的影响，使传统紫外光谱法带来的测量结果偏高的问题得到改进[32]。

近年来出现了不需要将样品事先分离即可消除共有组分的干扰的方法，如示差分光光度法，简便准确。

3.2色谱法
李青(2000)等人先用一定量的甲醇萃取10-HDA，快速震荡混匀1min后，取上清液，然后通过大口径毛细管交联柱分离，并使用氢火焰检测器检测，保持柱温在180℃，进样口240℃，气相色谱法直接测定，该方法消除了其他脂肪酸的干扰[33]。

刘满仓(1996)等人开发了一种只需稀释的高效液相色谱方法[34]，10-HDA的测定变得更为方便省时。

李蔚(2005)等人用Waters Oasis HLB固相萃取小柱处理样品，使样品中的10-HDA富集，其他杂质用水洗去后，然后用少量甲醇洗脱10-HDA，以实现相当程度的富集。

该方法简便，杂质去除完全[35]。

3.3酶联免疫吸附法（ELISA）
潘荣生(2001)等人在测定10-HDA时首次使用了这一方法，该方法的原理是先通过酯化保护10-HDA中的原始羧基，再加入琥珀酸酐，与结构另一端的羟基反应，引入一个带有羟基的“桥”。

将这个“桥”通过混合酸酐法与载体蛋白偶联，制备得到10-HDA免疫原。

酶联免疫吸附法方便快捷且准确，通过和液相色谱法平行对比，结果符合率为95%[36]。

410-HDA提取工艺
4.1乙醚萃取法
定量称量蜂王浆，将其溶解在乙醇中，离心后弃沉淀，加入1∶1体积比的乙醚进行萃取，震荡，静置10min，分层后，使用分液漏斗分液，乙醚层在40℃常压下用旋转蒸发器蒸出，然后将烧瓶中的残留物溶于少量乙醇（约2mL）中，于低温下静置结晶。

4.2乙醇萃取法
称取一定量的蜂王浆放入三角烧瓶中，以1∶3的比例加入95％的乙醇，充分振荡，静置2h，以5000r／min的转速离心20min，弃去沉淀，取上清液，向上清液中加入3倍体积的去离子水进行反萃取，震荡后放于-20℃冰箱中结晶5 h。

结晶后，趁冷微滤，并将滤饼置于室内风干，然后将其移至真空干燥器中干燥60min左右后得最终产物10-HDA。

5结语
21世纪以来，随着社会经济与生活水平的提高,人们对于功能性天然保健品的需求正在迅速增长。

基于王浆酸10-HDA具有多种生理学活性,是纯天然的生物保健品，10-HDA存在着巨大的发展前景。

它对肿瘤起到有效的抑制作用，有作为放疗和化疗理想的辅助药物的潜力,有改善机体的免疫系统活性的功能，因此作为预防癌症的新药，市场更加广阔。

然而，目前10-HDA抗癌具体工作机制尚未明确，对于10-HDA与许多种类的肿瘤的作用研究也尚属空白，还有许多工作需要深入探究。

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更换蜂王、壮大群势，是每个蜂农一年之中都会遇到的问题。

如果单纯长期自繁一个品种，会导致蜂王纯度提高，产卵力下降，卵死亡率增强，这对生产十分不利。

尤其是蜂群交尾，一般采用标准箱分区设置、分散摆放与蜂群分区放置的办法等来提高蜂王交尾率，但是要携带大量蜂箱，浪费许多蜂。

采用继箱小群交尾的办法可避免上述情况发生。

具体方法是：在王台成熟前2d ，打开继箱后巢门，让蜜蜂自由出入，2d 后采用塑料布、棉布等轻质材料在继箱巢门一侧分割能放置2张脾的小区，提取本箱带蜂子脾1张，外
加蜜脾1张，即成交尾群。

在每个巢门上方设立辨识标志，授台即可。

新蜂王产卵正常后，取出老蜂王2h ，打开小群底角沟通蜂群气味，把蜂王带脾调到巢箱即完成。

这样做的好处是能够利用大群的温度，保证子脾不受外界气温影响，子脾发育正常，群势小，便于观察新王交尾状况，减少了围王情况发生，能及时了解失王情况，便于补充王台，保障了蜂王成功数量。

大群繁殖没有中断，利于连续蜜源采集。

蜂群不会产生失王情绪，造成蜂群紊乱。

收稿日期：2019-10-14
●饲养管理
采用继箱小群交尾效果好
胡佑志
（四川省彭州市通济镇姚家村，四川彭州611942）
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