大肠杆菌高密度发酵

课程设计说明书
课程名称：发酵工程
设计题目：大肠杆菌的高密度发酵
院系：生物与食品工程学院
学生姓名：******
学号：************
专业班级：10生物工程（2）班
指导教师：*****
课程设计任务书
大肠杆菌的高密度
摘要：在工业生产过程中，由于技术或是生产条件的限制，在大肠杆菌高密度发酵培养中很难实现其高密度发酵。

针对这一问题，我组专门为此设计一实验来探索发酵过程中的限制性因素。

我们从开始的发酵培养基的组分及其配比，到后来的灭菌方式，投料程序以及在发酵过程中温度的设定控制，PH值的设定控制及溶氧的设定控制都进行了严格的监测，再到最后的OD值，氨基氮以及还原糖的测定都进行严谨的完成。

关键词：大肠杆菌高密度发酵OD值
目录
1.设计背景 (1)
1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状 (1)
1.2高密度发酵定义 (1)
1.3 规定标准 (1)
2.设计方案 (2)
3.方案实施 (3)
3.1 大肠杆菌简介 (3)
3.2 菌种选材 (3)
3.3 种子扩大培养 (3)
3.4 发酵培养基配比 (3)
3.5 发酵过程 (4)
4.结果与结论 (7)
5.收获与致谢 (9)
6.参考文献 (10)
1.设计背景
1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状
目前，在发酵产业进入工业化，自动化的今天，产品的高密度发酵越来越受到国内外的重视。

人们在根据实验与生产阶段总结的经验中，逐步掌握发酵生产所需要的最佳控制条件。

在此过程中所得的产品密度更大，纯度更高，质量安全也得到了保障。

1.2高密度发酵定义
高密度发酵（high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。

即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。

通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。

根据硒计算，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400 g(DCW／L)，考虑到实际情况中的种种条件限制，Makel等认为最高的菌体密度为200 g(DCW／L)，此时发酵液的25％充满了长3 um，宽1um的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。

1.3 规定标准
我国质量标准规定，根据大肠杆菌的高密度发酵，发酵罐中生物量达到150—200g/l。

根据这一标准，制定出整个试验生产计划。

微生物的发酵方式主要有分批、连续和补料分批3种。

在本次大肠杆菌发酵中，我们采用补料分批培养。

分批补料发酵定义：补料分批发酵以分批发酵为基础，是介于分批发酵与连续发酵之间的一种发酵技术。

在分批发酵培养开始，投入较低的浓度底物，当微生物开始消耗底物后，间歇或连续地补加新鲜培养基，而不从发酵罐中放出培养液的一种发酵方式。

这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。

使微生物处于最佳的生长环境。

这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。

补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。

在此过程中，我们使用50L发酵罐采用分批补料方式对大肠杆菌进行培养。

实时监测培养过程中的溶氧，PH以及温度等发酵参数，每隔两小时取料测定料液OD值，氨基氮，还原糖等数据。

直至大肠杆菌停止生长。

3.1 大肠杆菌简介
在自然界分布很广，是人和动物肠道中的正常菌群。

正常情况下一般不致病，但它是条件致病菌。

大肠杆菌是单细胞原核生物，具有原核生物的主要特征：细胞核为拟核，无核膜，细胞质中缺乏象高等动植物细胞中的线粒体、叶绿体等具膜结构的细胞器，核糖体为70S，以二分分裂繁殖。

其大小为：0.5～0.8μm×1.0～3.0μm。

周身鞭毛，能运动，具致育因子的菌株还具性菌毛。

其代谢类型是异养兼性厌氧型。

3.2 菌种选材
实验室保存大肠杆菌菌种
3.3 种子扩大培养
培养基：LB培养基（g/L）：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl10，PH7.0
液体试管培养：自斜面菌种挑取一环酵母菌体，接入装有10ml 的无菌种子培养基的液体试管中，摇匀，置于37℃培养箱24h。

三角瓶扩大培养：将上述培养好的液体试管种子接种入250ml含有灭过菌的100ml 培养基的三角瓶中，37℃培养箱中18h。

摇瓶培养：按照1%接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，37℃ 200r/min振荡培养
3.4 发酵培养基配比
培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏11.5，蛋白胨19.5，(NH4)2SO4 4、K2HPO4 18、MgS04 1.2（单独灭菌），微量元素液1mL。

流加培养基I(g/L)：葡萄糖600,7水硫酸镁10。

ph调节剂：0.5mol/L氨水
3.5 发酵过程
将已调配好的新鲜培养基注入发酵罐中，设定温度121℃，时间25 min，对发酵罐，培养基，葡葡糖溶液氨液和消泡剂进行同时灭菌操作。

如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在75％酒精中浸泡加进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上。

开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,直到冷却到发酵温度37 ℃。

利用硅皮管将25 g/100ml葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。

消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。

在发酵过程中，通气量控制在4L/min，搅拌转数为400rpm。

向发酵罐中接种之前已经扩大培养的菌种。

开动蠕动泵流加25g/100mL葡萄糖流加混合液，使发酵罐内葡萄糖浓度达到25g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养液pH为7.0，充入适量的消泡剂。

通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在30％左右。

每隔2h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度，并做记录。

取样口经常用75％的酒精浸泡以保持清洁。

当菌种停止繁殖时，菌种浓度不再增加，葡萄糖浓度不再改变时，停止发酵反应。

取发酵液样品，测定酵母菌浓度，还原糖，氨基氮，DO含量参数。

培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去。

清洗培养罐。

3.6 实验数据的测定
3.6．1斐林法测还原糖
试剂：①斐林试剂② 0.1%标准葡萄糖溶液
测定步骤：
①斐林试剂的标定：吸取斐林试剂甲、乙液各5Ml。

置于250mL三角瓶中，加
入10mL水，并从滴定管中预先加入约24mL0.1%标准葡萄糖溶液（其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液1mL以内），摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4～5秒每滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1min
中内完成，总消耗量为V 0 mL。

②定糖：
预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各 5mL，置于250mL三角瓶中，加入V 1 毫升试样稀释液（含葡萄糖量为 5 ～ 15 毫升）及适量多0 .1% 标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定时操作。

总耗糖量为 V 2 毫升。

正式实验：吸取斐林试剂甲、乙液各 5 毫升，置于 250mL 三角瓶中，加入 V 1 毫升试样稀释液和（ V 2 － 1）毫升 0.1% 标准葡萄糖溶液，补加 [（V 0 +10 ）－（ V 1 +V 2 ）] 毫升水，摇匀，以下操作同标定时操作，总耗糖量为 V 毫升。

3.6.1.3计算
葡萄糖 =（ V 0 -V ）×C×n×1/V 1（ g/mL ）。

3.6.2氨基氮的测定
基本原理
氨基酸是有氨基与羧基得两性化合物，在溶液中以两性离子状态存在。

如：R-CH--COO-+2HCHO
-NH3是弱酸，完全解离时pH在11-12之间或者更高，若用碱滴定- NH3释放出来的H+来测定氨基酸，一般指示剂的变色范围＜10，很难指示滴定终点。

但是用甲醛处理后，由于甲醛能与氨基结合使氨基上的氢离子游离，使溶液中的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色区域内（8.0-10.0）。

因此可用酚酞作指示剂，用碱来滴定，从而计算氨基酸的含量。

试剂：1mol/l盐酸，0.1mol/l氢氧化钠标准溶液，0.5mol/l氢氧化钠标准溶液，12%中性甲醛，0.2%甲基红指示剂，1%酚酞指示剂。

仪器及器具：100ml三角瓶，10ml刻度吸管，25ml刻度吸管，碱式滴定管取发酵离心上清液2.5ml至100ml三角瓶中，加水50ml，甲基红指示剂2滴，1mol/l盐酸1-2滴，调节溶液至红色，静置5分钟，再用0.5mol/l的氢氧化钠标准溶液调节溶液至橙色（体积不计），使呈中性。

加12%中性甲醛10ml(每次用之前用氢氧化钠溶液调至微红色，酚酞作为指示剂)，摇匀静置10min,加1%酚酞指示剂5滴，用0.1mol/l氢氧化钠溶液滴定至微红色为终点。

计算：氨基氮（mg/100ml）=C×V×14.01×100/2.5
C:氢氧化钠滴定液浓度，mol/l
V：氢氧化钠滴定液消耗体积，ml
3.6.3 OD法测菌体密度
原理：OD表示被检测物吸收掉的光密度。

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。

实验步骤
首先对配好的培养基进行检测光密度，以此作为对照。

其次，用三支试管取10的样品液，分别用磷酸盐缓冲液稀释稀释不同的倍数，
用wfj7200可见分光光度计在波长600nm下测定不同稀释不同稀释倍数的菌悬液以及对照样品的OD值。

计算:OD=㏒10(入射光/透射光）
4.结果与结论
表4.1大肠杆菌发酵液的OD值，氨基氮，还原糖数据
从整个实验过程中测得的实验数据可以观察到：氨基氮和还原糖的含量从开始略有上升到后来维持稳定。

主要原因是大肠杆菌在繁殖中需要碳源转化为葡萄糖为其提供能量，将氮源转化为氨基酸为其提供合成自身产物的原料，随着菌体密度的不断增大，两者的含量也不断升高，知道菌体密度维持稳定后两者的含量才稳定下来。

在测量OD数据时，第二次测得的数据具有失真现象，应当不予考虑，从实验数据的整体来看整个OD 值的走势还是符合大肠杆菌生长曲线的。

大肠杆菌起初被接种在发酵罐内，由于对发酵罐内的生活环境还不适应，菌体的繁殖速率降低，代谢物产量几乎处于停滞阶段，此时期被定为适应期；接着菌体对整个生存环境有了适应，其数目呈现几何级数增长，代谢产物也在不断积累，此时期为对数期；处于稳定期的菌体其繁殖的菌体数与衰亡的细胞数达到动态平衡，菌体产量达到最高点，其次生代谢产物也在此时期进行积累；最终军中衰老，活的菌种数量逐渐下降。

5. 收获与致谢
首先，本次课程设计是在****老师精心指导下完成的。

并且老师为我们组修改并制定了最佳课程设计的方案，每次我们有疑惑或者不是很懂的地方就会立即为我们讲解，让我们学到了很多的东西，并且也让我深深体会到只有动手去操作才能检验我们学到的东西。

最终，我们历经坎坷终于完成了本次的实验，我想，若没有他的指导，我们也没有今日的成功。

其次，我也非常感谢我组成员及其他同学的帮助，在我们的团结努力下，我们才能够顺利的完成了整个实验的筹备工作与发酵过程及最后的数据测定和分析。

经过本次实验，我懂得了实践能很好的检验我们的理论知识学习的好与坏，并且团队合作也是非常重要的。

6. 参考文献
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