γ-干扰素释放试验对活动性肺结核的辅助诊断价值

γ-干扰素释放试验对活动性肺结核的辅助诊断价值
曾谊;李太顺;宋梅梅;黄磊
【摘要】Objective To study the auxiliary diagnostic value of T-SPOT. TB for active tuberculosis. Meth-ods Rapid T-SPOT. TB assay was employed to detect Mycobacterium tuberculosis antigen specific T cells in blood samples from 153 cases with pulmonary tuberculosis ( the A group) and 81 cases with non TB pulmonary disease ( the B group), and also the antibody LAM, 16KD and 38KD in the two groups was detected by proteinchips. Results The sensitivity of T-SPOT. TB assay in active pulmonary tuberculosis was 78. 4% (120/153), and it was significantly higher than 24. 7% of the B group (20/81) (χ2 =80. 91, P<0. 001). The sensitivity of T-SPOT. TB assay was higher than that of tuberculosis antibody 16KD [10. 5% (χ2 =52. 26, P<0. 001)], but there was no statistical sig-nificance (χ2 = 0. 62, χ2 = 0. 50, P > 0. 05 ) compared with antibody 38KD ( 54. 9%) and antibody LAM (58. 8%). The specificity of T-SPOT. TB assay was 75. 3% (61/81), lower than antibody 16KD [84. 0% (χ2 =5. 59, P<0. 05)], but there was no statistical significance (χ2 =0. 45,χ2 =0. 50, P>0. 05) compared with anti-body 38KD (80. 2%) and antibody LAM (81. 5%). SFC count of ESAT-6 and CFP-10 in smear and culture positive pulmonary tuberculosis was respectively 47. 10 ± 34. 53 and 63. 02 ± 35. 92, and it was significantly higher than that in smear and culture negative pulmonary tuberculosis (P<0. 05, P<0. 01). SFC count of ESAT-6 and CFP-10 in severe patients was respectively 60. 84 ± 31. 76 and 74. 75 ± 33. 75, and it was significantly
higher than that in mild patients (P<0. 001). When the critical value of SFC count of ESAT-6 by ROC curve was 21. 5, the sensitivity was 74. 8%, and
the specificity was 94. 5%. When the critical value of SFC count of CFP-10 by ROC curve was 19. 5, the sensitivity was 77. 6%, and the specificity was 91. 8%. Conclusion Compared with serum tuberculosis antibod-y tests, T-SPOT. TB assay has a certain value in the diagnosis of active tuberculosis. SFC count of ESAT-6 and CFP-10 is correlated with the severity of the disease, and the specific value of SFC count has certain clinical significance.%目的探讨结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在活动性肺结核中的诊
断价值.方法应用T-SPOT.TB试剂盒对153例活动性肺结核(A组)和81例其他肺部疾病(B组)患者的外周血中MTB特异性T淋巴细胞进行检测,同时对两组患者进行LAM、16KD、38KD抗体的检测.结果 T-SPOT.TB对活动性肺结核的敏感性为78.4%(120/153),要明显高于对照组24.7%(20/81)(χ2=80.91,P<0.001).T-SPOT.TB检测的敏感性要明显高于16KD抗体10.5%(χ2=52.26,P<0.001)、也要高于38KD抗体(54.9%)、LAM抗体(58.8%),但其差异无统计学意义(χ2=0.62、
χ2=0.50,P值均>0.05).T-SPOT.TB检测的特异性为75.3%(61/81),要低于16KD
抗体84.0%(68/81)(χ2=5.59,P<0.05);也要低于38KD抗体80.2%(65/81)和
LAM抗体81.5%(65/81),但差异无统计学意义(χ2=0.45、χ2=0.50,P值均>0.05).菌阳患者的ESAT-6、CFP-10的SFC分别为47.10±34.53和63.02±35.92,要明显高于菌阴肺结核(P<0.05、P<0.01).重症患者的ESAT-6、CFP-10的SFC分别
为60.84±31.76和74.75±33.75,明显高于轻症患者(P<0.001).通过受试者工作特征曲线(ROC曲线),当EAST-6的SFC取值21.5时最具诊断价值,其灵敏度为
74.8%,特异度为94.5%;CFP-10取值19.5时最具诊断价值,灵敏度为77.6%,特异
度为91.8%.结论 T-SPOT.TB对活动性肺结核的诊断有一定的价值,和其他血清学
结核抗体检测相比有一定的优势,但并不十分突出.两种抗原的SFC值与疾病的轻重程度相关,SFC的具体数值有一定的临床价值和意义.
【期刊名称】《临床肺科杂志》
【年(卷),期】2017(022)005
【总页数】5页(P777-780,784)
【关键词】结核/诊断;γ-干扰素释放试验;酶联免疫斑点测定;蛋白芯片技术
【作者】曾谊;李太顺;宋梅梅;黄磊
【作者单位】210029 江苏南京,南京市胸科医院结核科;210009 江苏南京,东南大学公共卫生学院;210029 江苏南京,南京市胸科医院结核科;210029 江苏南京,南
京市胸科医院结核科
【正文语种】中文
γ-干扰素释放试验(IGRAs)作为结核病体外免疫诊断技术正式在中国用于临床诊断
已经有六年了。

中华医学会结核病学分会在2014年发布的γ-干扰素释放试验在
中国的应用建议[1]中指出：IGRAs是检测结核分枝杆菌(MTB)特异性抗原刺激T
细胞产生的γ-干扰素(IFN-γ)，可用于诊断MTB潜伏感染(1atent tuberculosis infection，LTBI)。

而临床上我们最关注的是IGRAs对于活动性肺结核的诊断价值，对此，国内的研究结果不尽相同，而且试验方法、样本量和入组标准也不一致，难以完整的诠释IGRAs的临床价值。

目前IGRAs的检测方法有两种[2]：① 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)：检测全血
中致敏T细胞再次受到MTB特异性抗原刺激后释放的IFN-γ水平，称之为全血检测或结核感染T细胞免疫检测；② 采用结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验：测定
在MTB特异性抗原刺激下，外周血单个核细胞中释放IFN-γ的效应T细胞数量，称之为T-SPOT.TB。

本研究拟采用T-SPOT.TB的方法来进一步说明IGRAs对活
动性肺结核的诊断价值，以及T-SPOT.TB检测具体数值的临床意义，及其与疾病
严重程度之间的关系。

一、研究对象
1 活动性肺结核组(A组)：2015年8月至2016年1月，南京市胸科医院结核鉴
别诊断科住院的活动性肺结核病人153例，男性85例，女性68例，男女比例为1.25 ∶1，平均年龄(49.6±12.3)岁(18-77岁)。

A组中菌阳肺结核(65例)，菌阴肺结核(88例)，均按中华医学会2005年颁布的《临床诊疗指南.结核病分册》[3]的相关标准进行诊断。

菌阳肺结核：直接痰涂片
镜检抗酸杆菌阳性或结核分枝杆菌培养阳性；菌阴肺结核：① 典型的结核临床症
状和胸部X线表现；② 抗结核治疗有效；③ 临床可排除其他非结核肺部病变；④ PPD试验强阳性；血清MTB抗体(MTB-AB)阳性；⑤ 痰MTB PCR+探针检测呈
阳性；⑥ 肺外组织病理证实结核病变；⑦ 支气管肺泡灌洗液(BALF)检出MTB；
⑧ 支气管或肺部组织病理证实为结核病变。

具备1-6中3项或7、8中1项可以
确诊。

同时，按症状轻重、病程长短及病变范围又划分为轻症组(80例)和重症组(73例)，轻症组为初发病人，查体发现肺部病灶或有轻度临床症状，X线检查提示浸润性病灶累及一侧肺的1至2个肺叶；重症组有明显的结核中毒症状，病程较长，X线
检查提示病灶累及3个肺叶以上，或伴有空洞形成[4]。

2 非结核呼吸系统疾病对照组(B组)：同期在南京市胸科医院呼吸内科及鉴别诊断
科的住院患者81例，包括原发性支气管肺癌、支气管肺炎、大叶性肺炎、支气管扩张、慢性支气管炎、特发性肺间质纤维化、细菌性肺脓肿等，均取得病理学或病原学诊断依据，且排除肺结核或肺外结核病。

其中男46例，女35例，男女比例
为1.31 ∶1；平均年龄(51.2±11.6)岁(23-80岁)。

二、检测方法
1 T-SPOT.TB检测方法：按T-SPOT.TB试剂盒(上海复星科技有限公司)操作规范
进行。

取患者静脉血6 mL， 6小时内分离外周血单个核细胞(PBMC)，用细胞培
养基AIM-V(GIBCO公司)重悬细胞，并将浓度调整至2.5×106/mL。

在已包被抗IFN-γ单抗的96个孔板上，分别单孔加入50 μL细胞培养基作为空白对照，50
μL植物血凝素作为阳性对照，每孔加入50 μL MTB特异性早期分泌靶抗原
6(ESAT-6)和培养过滤蛋白10(CFP-10)肽段库(终浓度10 μg/mL)作为刺激原(Oxford，英国)。

然后在每个孔中加入100 μL上述细胞悬液。

37℃孵箱培养16-20h后，用PBS缓冲液(GIBCO公司)洗板4次，加入碱性磷酸酶标记的二抗50
μL，在2-8℃下孵育1h，孵育后再用PBS缓冲液洗板4次。

最后每孔加入显色底物液5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸盐-四氮唑兰50 μL，室温中静置7 min后去离子水终止反应。

观察结果，并用ELISPOT计数仪(KS Elispot version 4.9，ZEISS，德国)计算MTB感染T淋巴细胞所对应的斑点数(SFC)。

结果判定：据测试孔A(ESAT-6)和/或测试孔B(CFP-10)的反应来判断结果：如果
阴性对照孔SFC为0-5，(测试孔A和/或B SFC)-(阴性对照孔SFC)≥6视为阳性；当阴性对照孔SFC≥6，(测试孔A和/或B SFC)≥2*(阴性对照孔SFC)视为阳性[5]。

2 结核抗体检查:试验仪器和试剂采用南京大渊生物技术工程有限责任公司生产的PBT-X4型生物芯片识别仪和结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒(蛋白芯片)，采用蛋白芯片法检测血清LAM、16KD、和38KD抗体水平，取静脉血5mL，分离血清，具体的操作步骤严格按照试剂盒说明进行。

三、统计学方法
采用SPSS19.0版统计学软件进行分析，分类资料采用χ2检验，计量资料采用t
检验，以P<0.05有统计学意义，应用SPSS中的受试者工作特性曲线(receiver
operator characteristic curve，ROC曲线)，进行科学评价，把方法的灵敏度与
特异度结合分析。

一、T-SPOT.TB在两组中的检测结果
A组T-SPOT.TB检测阳性的例数是120例，占78.4%，B组的阳性例数是20例，占24.7%，两组对比A组明显高于B组，差异有统计学意义，χ2=80.91，
P<0.001。

T-SPOT．TB检测在活动性肺结核诊断中的敏感度为78.4%，特异度
为75.3%(见表1)。

二、T-SPOT.TB与MTB抗体的比较
两组患者分别进行T-SPOT.TB检测和MTB 16KD、38KD、LAM抗体的检测，结果(见表2)。

T-SPOT.TB检测对活动性肺结核诊断的敏感性为78.4%，要明显高于16KD抗体(10.5%)(χ2=52.26，P<0.001)、也高于38KD抗体(54.9%)、LAM抗体(58.8%)，但其差异无统计学意义(χ2=0.62、χ2=0.50，P值均>0.05)。

T-SPOT.TB检测的特异度为75.3%，要低于16KD抗体84.0%，两者相比较有统计学意义(χ2=5.59，P<0.05)；也低于38KD抗体(80.2%)和LAM抗体(81.5%)，但差异无统计学意义(χ2=0.45、χ2=0.50，P值均>0.05)。

三、T-SPOT.TB在菌阳肺结核和菌阴肺结核检测结果的比较
菌阳肺结核组中，ESAT-6的SFC为47.10±34.53，要明显高于菌阴肺结核的32.87±21.79(t=2.231 P<0.05)；CFP-10在菌阳肺结核组的SFC为
63.02±35.92，也要高于菌阴肺结核的39.12±28.11(t=3.04 P<0.01)。

提示T-SPOT.TB的检测结果在菌阳和菌阴肺结核中有明显的差异。

(见表3)。

四、T-SPOT.TB在重症和轻症肺结核检测结果的比较
重症组中，ESAT-6的SFC为60.84±31.76，要明显高于轻症组的
18.71±8.66(t=7.912 P<0.001)；CFP-10在重症组的SFC为74.75±33.75，也
要高于轻症组的25.61±15.17(t=7.178 P<0.001)。

提示T-SPOT.TB的检测对于
活动性肺结核不同的病变程度，其检测结果亦有显著的差异。

(见表4)
五、应用ROC曲线说明T-SPOT.TB对活动性肺结核的诊断价值
根据A组、B组中T-SPOT.TB检测的SFC数值，可分别得到ESAT-6和CFP-10
的ROC工作曲线(见图1)，其中ESAT-6的ROC曲线下面积为0.895，标准误为0.021，95%的渐近置信区间为(0.854，0.936)，当EAST-6取值21.5时最具诊断价值，其灵敏度为74.8%，特异度为94.5%；CFP-10的ROC曲线下面积为
0.886，标准误为0.022，95%的渐近置信区间为(0.844，0.929)，当CFP-10取
值19.5时最具诊断价值，灵敏度为77.6%，特异度为91.8%。

T-SPOT.TB现已被公认为是检测MTB感染的诊断技术。

其技术原理是机体感染MTB后，血液中的记忆性T淋巴细胞和单核细胞会在再次接触MTB特异性抗原
时产生和分泌相应的细胞因子(IFN-γ)。

在体外试验时，选取了存在于MTB，但在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中普遍缺少的RDl区编码的ESAT-6和CFP-10
蛋白作为刺激抗原，刺激受试者外周血中的T淋巴细胞，通过酶联免疫斑点技术，计数分泌IFN-γ的T淋巴细胞数量来判断是否存在MTB特异性活化的效应T细胞，进而判断是否存在结核分枝杆菌感染。

根据多项研究结果证实T-SPOT.TB在LTBI 的诊断中有着较高的敏感性和特异性[6-7]，该试验已被CDC推荐作为筛查及诊断结核分枝杆菌感染的方法之一[8]。

作为临床医生我们更关注的是T-SPOT.TB对于活动性肺结核的诊断价值，目前，国外有文献报道，T-SPOT.TB在中/低收入国家诊断肺结核的综合敏感度为
83%(95%CI为63%-94%)，综合特异度为61%(95%CI为40%-79%)[9]。

国内
多数研究结果提示，T-SPOT.TB检测对疑似肺结核的诊断敏感度为77%-95%，
特异度为71.7%-93%[10-12]。

本研究应用T-SPOT.TB的方法对153例活动性肺结核患者和81例非结核其他肺部疾病患者的外周血单个核细胞进行检测，结果显示T-SPOT.TB对于活动性肺结核的敏感性为78.4%(120/153)，特异性为
75.3%(61/81)，与上述研究结果相符，进一步证实T-SPOT.TB对活动性肺结核的诊断是有一定参考价值的。

本研究还将T-SPOT.TB与MTB的LAM、16KD、
38KD抗体水平检测做了比较，结果显示：T-SPOT.TB检测在活动性肺结核的敏感性(78.4%)，要高于LAM抗体的58.8%(90/153)和38KD抗体的
54.9%(84/153)，但差异无统计学意义(P>0.05)，明显高于16KD抗体
10.5%(16/153)，P<0.001。

T-SPOT.TB检测的特异性(75.3%)与LAM抗体81.5%(65/81)及38KD抗体80.2%(65/81)的检测结果相似，差异无统计学意义(P>0.05)，说明T-SPOT.TB检测对于活动性肺结核的诊断对比蛋白芯片技术检测MTB抗体(LAM、38KD)有一定的优势，但并不十分明显。

16KD抗体检测的特异性虽然比较高84.0%(68/81)，但其敏感性过低，所以作者认为不太适合将其单独作为诊断活动性肺结核的指标，其价值应该体现在与其他指标联合检测，提高诊断的特异性上。

T-SPOT.TB检测中，ESAT-6和CFP-10的SFC数值代表受到MTB特异性抗原刺激后，外周血单核细胞中释放IFN-γ的效应性T淋巴细胞的数量，SFC数值越高提示参与免疫应答的T淋巴细胞越多，细胞免疫越活跃。

最近有研究显示，活动性肺结核较非活动性肺结核IFN-γ释放试验有更高的应答，IFN-γ释放反应的量值可直接反映出MTB特异性抗原的负荷[13]。

本研究结果显示：痰菌阳性患者的ESAT-6、CFP-10的SFC分别为47.10±34.53和63.02±35.92，要明显高于菌阴肺结核，其差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。

在重症肺结核组中，ESAT-6、CFP-10的SFC分别为60.84±31.76和74.75±33.75，也要明显高于轻症组
(P<0.001)。

故考虑，T-SPOT.TB检测中两种特异性抗原的SFC数值与肺结核病灶的严重程度和MTB的菌量负荷相关。

在菌阳和病变范围广泛的病例中，机体对MTB特异性抗原的免疫应答能力增强，因此表现为受抗原刺激后释放IFN-γ的T 细胞斑点数增高。

目前T-SPOT.TB是以两个特异性抗原刺激后，T淋巴细胞的SFC的具体数值作为定量的表达，本研究通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)，以SFC为分界值用于
鉴别活动性肺结核和非肺结核的其他疾病，发现当EAST-6取值21.5时最具诊断
价值，其灵敏度为74.8%，特异度为94.5%；CFP-10取值19.5时最具诊断价值，灵敏度为77.6%，特异度为91.8%，为进一步分析T-SPOT.TB的试验结果提供了依据。

总之，T-SPOT.TB 检测对活动性肺结核的诊断有较高的敏感性和特异性，和其他
临床常用的血清学结核抗体检测指标相比较有一定的优势，但并不十分突出。

两种抗原的SFC值与疾病的轻重程度相关，且SFC的具体数值有一定的临床价值和意义。

但由于本试验的样本量偏少，要得出SFC值的具体影响因素，诸如，年龄、
合并症等，尚需更大样本量的研究。

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