蛋白质组学—蛋白质与生物大分子的相互作用研究

PAGE
YY
Co-immunoprecipitation
Western blot 鉴定
binding
wash
elution
质谱
细菌蛋白质的“protein A”可特异性 地结合到免疫球蛋白的Fc片段
Co-IP鉴定蛋白相互作用
实验注意事项
细胞裂解采用温和的裂解条件（NP40、TritonX100等）；每种细胞的裂解条件是不一样的，通 过经验确定。
ZBED6, a Novel Transcription Factor Derived from a Domesticated DNA Transposon Regulates IGF2 Expression and Muscle Growth. PLoS Biology, 2009, 7（12）：1-13
➢ Add 800μl protein G-agarose beads and 20–25μg GFP antibody (Clontech) to the supernatant. Incubate overnight at 4°C on a rotating apparatus.
➢ Wash beads five times with 1 ml PBS for 2 min each wash. ➢ Resuspend pellet in 50-80μl 2× SDS sample buffer.Load 10–
The Polymeric Immunoglobulin Receptor Translocates Pneumococci across Human Nasopharyngeal Epithelial Cells. Cell, 2000, 102:827–837（筛选、鉴定）
polymeric immunoglobulin receptor (pIgR) CbpA
methods
蛋白表达：Expression of CbpA Polypeptides (6×His）
Pull-down：Affinity Purification of the CbpA Binding Proteins
蛋白鉴定：Proteins in the fractions were analyzed by SDS-PAGE and IB，and N-Terminal Sequencing of the CbpA Binding Proteins
15 μl of supernatant on an SDS/polyacrylamide gel.
D39-ClpE-GFP ClpP
IB:GFP
D39 D39-ClpE-GFP ClpP
IB: ClpE
Marker D39-ClpE-GFP D39 97.2kD
优点：
• 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天 然状态；
Cell lysates were prepared in a buffer containing protease inhibitors；
Cellular debris was removed by centrifugation at 4℃， The supernatant was recycled through the CbpA1affinity column for 4 h at 4℃；
• 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避 免人为的影响。
难点： • 需要高质量的抗体进行IP； • 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有
第三者在中间起桥梁作用； • 检测不到弱或瞬时的相互作用。
染色质免疫共沉淀
（Chromatin Immuno -precipitation, ChIP）
分析小分子化合物对 蛋白相互作用的干扰
TRAM
Screening of ClpE interaction proteins
Construct recombinant plasmid pAE03-ClpE and transform into S. pneumoniae D39
Western blot for identification
应用：分析与蛋白质相 互作用的DNA序列信息
Chip-seq技术 可获得数百万条序列标签，并能把所关注的蛋 白的DNA结合位点精确定位到基因组上。
华大基因、上海生物芯片有限、上海康成生物有限公司等
Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions. Science, 2007, 316(5830): 14971502
cytoplasm nucleus
主要内容
免疫共沉淀(Co-IP)：蛋白—蛋白，蛋白— DNA
Pulldown（亲和层析）：蛋白—蛋白，蛋 白—DNA/RNA
电泳迁移实验(EMSA)：蛋白—DNA/RNA 酵母双杂交系统：蛋白—（X）—蛋白
一、免疫共沉淀（in vivo）
Co-Immunoprecipitation，Co-IP
原理：利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质 （诱饵蛋白）固定于某种基质上(如Sepharose)， 当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相 互作用的配体蛋白被吸附，通过改变洗脱液或洗 脱条件即可回收所吸附的蛋白。
固定诱 饵蛋白 （1）
洗脱 （2）
结合 （3）
检测 （6）
收集 （5）
洗脱 （4）
Ellen Markljung等发 现抑制家猪IGF2基因 表达的因子是ZBED6 蛋白；
进一步用Chip-seq研 究ZBED6蛋白的作用 靶点。
ZBED6蛋白的1200个作用靶点起着 发育、转录调控、细胞分化等作用。
二、Pull-down实验（in vitro）
用途： 1.鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用 2.筛选与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质
分析靶蛋白与小分子化 合物的作用：
➢The immunoprecipitates were separated using SDS-PAGE immunoblotting with antiFLAG M2 mAb or anti-HA tag mAb. analyzed using autoradiography.
Johnson等利用 ChIP-seq 对转录因子NRSF(神经元限 制性沉默因子)在DNA上的结合位点进行了全基因组的筛查:
结果： ➢ 获得了1946个结 合位点； ➢ 结合位点的最小 能分辨为50bp。
获得的经典与非经典的神经限制性沉默元件 (NRSE)序列。
高质量的ChIP-seq结果提供了研究新的DNA-蛋白相互作 用的内容，发现其为胰岛发育调控网络中的重要转录因子。
蛋白质与生物大分子 的相互作用研究
Hale Waihona Puke 基因的功能研究成为热点，研究的对象即为基 因编码的产物—蛋白质，生物功能的主要体现者 和执行者。
在所有生命活动中，细胞接受外源或是内源的 信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表 达，以保持其生物学特性，这其中必须涉及蛋白 与蛋白、核酸的相互作用。
掌握或发明研究相互 作用的方法非常重要。
The hpIgR-mediated bacterial adherence and invasion were abolished by either insertional knockout of cbpA or antibodies against either hpIgR or CbpA.
确保共沉淀的蛋白是由所加入的特异性抗体沉淀 得到的，而并非其他非特异蛋白：
1、使用单克隆抗体：多抗？ 2、使用对照抗体： （1）单克隆抗体：正常小鼠IgG或另一类单抗 （2）兔多克隆抗体：正常兔IgG。
Structural basis of G protein–coupled receptor–G protein interactions。Nature Chem Biol, 2010, 6:
用途：
1. 鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合，结合位点 分析；
2. 筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。
原理：
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内 存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留 了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么 与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。
Co-IP工作原理示意图
wash the column with washing buffer；
the bound proteins were eluted in 300 ml fractions with 100mM glycine-HCl (pH 2.5)。
Pull down筛选CbpA在A549上的受体：
Lane 1 CbpA-GST表达全菌， Lane 2 A549细胞膜蛋白溶解液， Lane 3 Pull down纯化大柱穿透液， Lane 4 Pull down spin columun 柱穿透液1 ，Lane 5 Pull down spin columun柱穿透液2， Lane 6 pull down筛检结果，Lane 7 pull down 阴性对照结果.
TAK-242 (Resatorvid), a Small Molecule Inhibitor of Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling, Binds Selectively to TLR4 and Interferes with Interactions between TLR4 and Its Adaptor Molecules. Mol Pharmacol, 2011,79:34-41（鉴定）
Co-Immunoprecipitation (Co-IP) ➢ transfer 1ml（OD600=0.5-0.6）cleared lysate of D39 and
D39-ClpE-GFP to a 10ml beaker separately.
➢ Add 500μl protein G-agarose beads (GE) , incubate for 3h at 4°C on a rotating apparatus with magnetic stirrer to remove non-specifically bound proteins.
rCbpA Covalently conjugated to 1 ml of Affi-Gel 15 (BioRad) in 0.1 M MOPS (pH 7.5) at 4℃；
The column was sequentially washed with washing buffer；
Detroit cells surface proteins were labeled with SulfoNHS-LC-biotin；
541-548（分析蛋白相互作用的位点）
大鼠G蛋白耦联受体M3R
G蛋白α（绿色）β（蓝色） γ（紫色）亚基
G蛋白藕联受体信号转导示意图
将不同变异体的表达质粒共转染入cos-7细胞中，单独转 染的为对照；左图为IP前的IB,右图为IP后的IB，二者复合 物为80kD（阳性结果）。图为两次独立实验的其中一次。
类均相Pull-down 鉴定hplgR与CbpA结合的区段及是否需要糖基化
rCbpA were immobilized on carboxylated latex beads. Latex beads coated with CbpA polypeptides were resuspended in 100µl of PBS/Mg2+/Ca2+ and 0.1% Triton X-100, and mixed with 100µl of hSC（plgR胞 外部分）. Unbound proteins were removed by extensive washing buffer. The beads were then resuspended in SDS-PAGE loading buffer to solubilize bound proteins. Proteins were separated in SDS-PAGE gels and detected by IB.