固氮芽孢杆菌的分离鉴定以及固氮巨...

分类号：单位代码：10019
密级：学号：S02402
硕士学位论文
固氮芽孢杆菌的分离鉴定以及固氮巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）C4在玉米、水稻、
小麦上的定殖研究
Isolation and Identification of Nitrogen-fixing Bacillus and
Colonization of Maize, Rice and Wheat by Nitrogen-fixing
Bacillus megaterium C4
研究生：刘旭明
指导教师：陈三凤教授
申请学位门类级别：理学硕士
专业名称：微生物学
研究方向：微生物遗传
所在学院：生物学院
2005年6月
China Agricultural University
Master Dissertation
Isolation and Identification of Nitrogen-fixing Bacillus and Colonization of Maize, Rice and Wheat by Nitrogen-fixing
Bacillus megaterium C4
Master Candidate: Liu Xuming
Mentor: Chen Sanfeng
Major: Microbiology
Department of Microbiology
College of Biological Sciences
China Agricultural University
Beijing 100094, P.R. China
独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名：时间：年月日
关于论文使用授权的说明
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(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)
研究生签名：时间：年月日
导师签名：时间：年月日
摘要
用gfp基因标记了固氮巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）C4。

用标记菌接种玉米（品种农大108），水稻（品种爱知旭）和小麦（品种扬麦）植株，在限菌条件下培养。

在接种后的第1、3、5、7、9和11天，对玉米鲜根进行光学切片，然后在共聚焦激光显微镜下进行观察。

观察结果显示，在接种后的第1天，标记菌主要定殖在初生根和次生根的根表面及初生根和次生根的交联处; 在接种后的第3天，标记菌进入到玉米根的皮层，细菌细胞主要位于细胞间隙，少数细菌细胞进入到下面的细胞内，即：表皮细胞、根毛细胞、皮层细胞；在接种后的第5天，细菌进入内部皮层，少数进入到维管柱；在接种后的第7天，明显的显示出细菌进入到维管柱，到达木质部和髓，导管内有少量细菌的侵入；接种后的第9天和第11天的观察结果与第7天类似。

细菌可能通过初生根和次生根的交联处及表皮细胞这两条途径完成对玉米根的侵染。

在接种后的第30和40天对玉米茎、叶分别取样进行观察，发现在茎、叶中有标记菌定殖，说明细菌可以由根部向地上部迁移。

在接种后的第1、3、5、7天，分别对水稻根和小麦根取样，在共聚焦激光显微镜下进行观察。

结果表明标记菌侵染水稻根和小麦根的过程与在玉米中相似，并定殖在皮层和维管柱。

实验揭示了标记菌侵入水稻根的两个位点为：根尖（伸长区）以及初生根和次生根的交联处。

通过抗生素抗性，选择性地从玉米根、茎和叶对标记菌进行跟踪检测和计数：接种后的第3天，玉米根部标记菌的浓度是103.2 CFU/g FW；接种后的第9天，根部标记菌的浓度达到107.1CFU/g FW；接种后的第30天，叶和茎中标记菌的浓度分别达到108.2 CFU/g FW和104.3 CFU/g FW。

从全国15个省份采取来自不同植物根际的土样，制成菌悬液后煮沸15 min，涂布无氮平板以分离固氮芽孢杆菌。

对分离到的菌株用菌落PCR扩增nifH基因片段，并采用乙炔还原法测定其固氮酶活。

从中筛选出116株既能扩出nifH基因片段又能测出固氮酶活的芽孢杆菌，其中有7株菌的固氮酶活超过了模式菌株固氮类芽孢杆菌（P .azotofixans）DSM1735.
关键词：Bacillus megaterium C4；GFP-标记; 定殖；固氮芽孢杆菌；分离；鉴定
Abstract
Bacillus megaterium C4, a nitrogen-fixing bacterium, was marked with gfp gene. Maize , rice and wheat seedlings were inoculated with the GFP-labeled B. megaterium C4 and then grown in gnotobiotic condition. The maize roots, stems, leaves，rice roots and wheat roots were optically sectioned and observed under confocal laser scanning microscope. Observations of the maize root sections at 1, 3, 5, 7, 9 and 11 days after inoculation showed significantly the infection process that the bacterial cells infected the maize roots from the root surfaces to the steles. One day after inoculation, the bacteria colonized mainly the surfaces of primary and lateral roots, and the junctions between primary root and lateral root. Three days after inoculation, the bacterial cells colonized cortexes. Five days after inoculation, the bacteria had progressed towards inner cortex. Seven days after inoculation, the bacteria reached vascular stele and penetrated into xylem and pith. The bacteria were mainly located in the intercellular spaces, although a few bacterial cells also were present within the xylem vessels, root hair cells, epidermis, cortical parenchyma and pith cells. A probable site of entry into maize roots for the bacteria was cracks formed at the lateral root junctions. Microscopic observations of the sections of maize stems and leaves at 30 and 40 days after inoculation revealed that the bacteria were present in stems and leaves at 30 and 40 days after inoculation, indicating that the bacteria migrated slowly from roots to stems and leaves.
Colonization studies of rice roots and wheat roots at 1, 3 , 5 , 7 days after inoculation revealed clearly the infection process on rice roots and wheat roots was similar to that on maize roots, and the bacterial cells were found to colonize epidermis, cortex and vascular tissues of rice root and wheat root. It also indicated that the root tip in the zone of elongation and the junctions between the primary and the lateral roots were the two sites for the bacteria entry into rice root.
The population of the bacterial cells colonized in the maize roots, stems and leaves were estimated by counting colony-forming units on selective medium. The population in roots reached 103.2 CFU/g FW at 3 days after inoculation, and gradually increased to 107.1 CFU/g FW at 9 days after inoculation. At 30 days after inoculation, the bacterial population reached 108.2 CFU/g FW in leaves and 104.3 CFU/g FW in stems.
Soil samples of different plant rhizosphere were collected from fifteen provinces. They were made into suspensions and seethed for 15 min, then plated on nitrogen-free medium in order to isolate nitrogen- fixing bacillus. Colony PCR was used to amplify nifH gene segment and nitrogenase activity was determined by acetylene reduction method. 116 strains of nitrogen-fixing bacillus which both have nifH gene segment and nitrogenase activity were acquired, and nitrogenase activities of 7 strains exceeded that of type strain P.azotofixans DSM1735.
Key words:Bacillus megaterium C4; GFP-labeled; colonization; nitrogen- fixing bacillus; isolation;
identification
目录
第一章 文献综述 (1)
1.1生物固氮的研究意义 (1)
1.2联合固氮菌研究进展 (1)
1.3内生联合固氮研究进展 (7)
1.4植物联合固氮菌分子生态学的研究方法及应用 (12)
立论依据与研究意义 (16)
第二章 固氮巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）C4在玉米、水稻和小麦中的定殖研究 (18)
2.1前言 (18)
2.2材料与方法 (18)
2.3结果 (20)
2.4讨论 (31)
第三章 固氮芽孢杆菌的分离及固氮特性的初步鉴定 (33)
3.1 前言 (33)
3.2 材料与方法 (33)
3.3 结果 (35)
3.4讨 论 (37)
第四章 结 论 (39)
参考文献 (40)
致 谢 (51)
作 者 简 历 (52)
第一章 文献综述
1.1生物固氮的研究意义
氮素是植物的主要营养原料之一.自然界广泛分布着大量的氮素,但植物只能利用化合态氮而不能直接利用分子态氮.固氮微生物具有固定大气中氮素的能力,使氮气转变为植物可以利用的形态.分子氮在生物体内由固氮酶催化还原为氨的过程称为生物固氮作用.
据联合国粮农组织(FAO)1995年的粗略估计,全球每年由生物固定的氮量已近2×106t,约占全球植物需氮量的3/4.生物固氮是全球规模最大的天然固氮工厂.但是迄今为止所发现的绝大多数固氮微生物均不能在粮食作物水稻、玉米、小麦以及多种果树、蔬菜上固氮。

即使少数可以，其固氮量也很少.所以这些植物的高产不得不依赖于化学氮肥.适量的施用化学氮肥可以提高粮食产量,但生产化学氮肥要消耗大量的能量,加重大气污染和温室效应.大量施用化肥,不仅提高农业生产成本,而且导致水土污染,影响健康,破坏生态平衡.生物固氮对于提高农业产量，降低化肥用量和农业生产成本,减少水土污染和疾病,治理国土荒漠化,发展可持续农业将起到重要的作用。

1.2联合固氮菌研究进展
1.2.1联合固氮菌的研究意义
生物固氮是自然界重要的生物学过程。

它主要有三大类：自生固氮（如自生固氮菌），共生固氮（如根瘤菌与豆科植物共生）和联合固氮（如产碱菌与水稻根际的联生）。

70年代，巴西学者Dobereiner从雀稗根表粘质层里分离出固氮酶活性很强的雀稗固氮菌（Azotobacter paspali）(Dobereiner J et al., 1972)，继而又从玉米等植物的根表分离出具固氮能力的产脂刚螺菌（Spirillum Lipoferum）(Dobereiner J et al., 1976)，联合固氮作用的概念才被提出。

联合固氮（Associative N2-fixing）是指某些固氮细菌在高等植物根际形成的特殊的共生固氮作用。

这种固氮体系的固氮细菌和植物具有较密切的关系，但又不与其形成特殊的共生结构：它们聚居于植物根际或根内，并对所联合的植物有一定的专一性。

固氮细菌从植物获得光合产物作为碳源和能源，植物则得到固氮菌固定的氮和分泌的生物活性物(窦新田等，1989)。

自1972年巴西Dobereiner实验室在禾本科植物根际发现联合固氮菌并提出根际联合固氮菌的概念以来，联合固氮的研究受到极大的重视。

由于联合固氮菌的主要宿主是粮食作物（水稻、玉米、小麦），研究联合固氮菌的特性与植物之间的相互关系及在田间的接种效益，自然成为人们关注的热点。

大量的试验结果表明，接种固氮菌在各种环境和土壤条件下对牧草和谷物是有益的。

然而，在这个系统中生物固氮由于受多种因素的限制，对植物生长和产量的贡献却非常低。

联合固氮菌对植物生长的促进效应，主要来自固氮菌分泌的植物激素使被接种植物的根形态和生理发生变化，从而增强了对水分和矿物营养的吸收。

由于联合固氮菌与植物根系之间只是一种松散的联合，没有分化出有形的结构，这使研究植物与细菌之间的相互关系遇到很大困难，致使这方面的知识仍非常有限，远不如共生细菌或病源菌与植物之间相互关系研究的深入。

尽管如此，联合固氮研究近年来仍然得到迅速的发展。

究其原因，一是作为主要粮食作物的水稻、小麦和玉米等非豆科植物尚不能自主固氮；二是尽管接种的效应机理尚不完全清楚，但施用联合固氮菌剂的确有一定的效果。

加之目前化肥用量不断增加，土壤肥力日趋下降，如何保持农业生态环境的良好循环已成为当今世界现代农业的一个重大课题。

在此背景下，根际联合固氮作用逐渐显出其特殊的意义。

20世纪80年代后期，分子生物学等现代高新技术的发展与渗透，对联合固氮作用机理的研究起到了重要的推动作用，新的成果层出不穷。

联合固氮在农业中的潜在经济价值已开始呈现，应用前景令人瞩目。

1.2.2 几种根际联合固氮体系
1.2.2.1 能与植物联生的联合固氮菌
联合固氮体系广泛存在于禾本科作物和牧草的根际和根表。

从细菌方面讲，被证实能与植物联合共生固氮的细菌已达16属30种以上。

1.2.2.2 固氮螺菌（Azospirillum）及其接种效应
对联合固氮菌的研究以固氮螺菌最多。

此属常见的两种是产脂固氮螺菌和巴西固氮螺菌，前者主要与C4植物联生，后者多与C3植物联生(曾定等，1987)。

与固氮螺菌联合固氮的植物有玉米、小麦、水稻、高粱、黑麦、甘蔗、谷类等农作物。

固氮螺菌还与各种牧草植物营联合固氮。

接种固氮螺菌有益于谷物生长的事实已得到普遍承认。

据Ghonsikar等报道，高梁接种固氮螺菌后根量增加了29％，根体积增加了39％，籽粒增产18％，饲草增加43％。

以对珍珠粟（Pennisetum americanum）接种来说，Smith等在只施少量氮肥的情况下，接种产脂固氮螺菌，收获的干物质较对照大大增高，相当于每公顷施用42Kg氮肥的产量。

Tien等测定出巴西固氮螺菌产生的TAA、GA和至少三种类CTK物质，这些物质使珍珠粟的侧根数量增加且所有侧根均被浓密的根毛、主根则得到伸长。

土壤质地不同接种产生不同效果，如对Setaria italica接种巴西固氮螺菌，结果沙地干重增加80％，全氮增加15％；沙壤土干重增加80％，全氮增加75％；黄土干重增加37％，全氮增加25％(Okon et al., 1980)。

Albrecht对Zea mays接种巴西固氮螺菌的实验表明，室内实验无论植株干重和全氮量均只较对照有轻微的增加，而田间实验则二者均得到增加，平均固氮量为14～15kgN/hm2。

在印度，固氮螺菌已作为一种菌肥而得到较广泛的应用。

总的来看，接种固氮螺菌的增产效果，与菌株品质、接种方式、生产措施和土壤状况等诸多因素有关(曾定等，1987)。

1.2.2.3 产碱菌
产碱菌属在伯杰手册第八版中属不固氮类型。

但1981年丘元盛等人从水稻的根系上分离出了能固氮的粪产碱菌。

1991年谢莉华等人又从马尾松根系上分离到能固氮的争论产碱菌。

目前本属中有四种联合固氮菌。

本属中研究最广泛的是粪产碱菌。

从水稻、玉米和甘蔗等的根系上均分离到了粪产碱菌。

近几年国内学者对其生物学特性和遗传学进行了深入而广泛的研究。

人们已从基因水平着手研究，以构建粪产碱菌的基因文库，并利用遗传工程技术将含有固氮的DNA片段的质粒转入某些野生型粪产碱菌菌株，结果这些转化子在高铵下表现出固氮活性并集聚在水稻根表（而相同条件下野生型则远离根表），其固氮率为20％。

但试验表明，必须选育出新的更加耐铵的工程菌株才有可能在粮田上普遍使用。

1.2.3 几种重要的联合固氮体系
联合固氮体系从植物方面讲，国内主要有玉米、小麦、高粱、水稻、甘蔗、棉花等农作物。

国外主要有小麦（Triticum）、大麦（Hordium）、裸麦（Secale）、玉蜀黍（Zea）、珍珠粟（Pennisetum）、高粱（Sorghum）、水稻（Oryza）、甘蔗（Saccharum）等属作物和热带亚热带牧草如雀稗（Paspalum）、马唐（Digitaria）、大米草（Spartina）属等(Sano et al., 1981)。

而对乔木树种根际联合固氮菌的研究则仅见于芒果和马尾松两种。

1.2.3.1 水稻
在水稻方面，尤崇杓等从水稻根中分离出粪产碱菌A-15(Alcaligenes facalis)具有较高的固氮活性，且这种细菌在我国水稻中广泛分布，该菌在微好氧下能够固氮。

应用15N示踪技术证明，联合固氮菌在生长过程中能分泌氨和其他含氮物质，其中有相当一部分能被水稻迅速吸收，并转移到植株的各个部位。

张跃林研究发现该菌株大部分附着在水稻根表，并聚集呈块状，靠水稻根提供碳源进行联合共生固氮作用。

周淑萍等应用15N示踪法证实了用该菌株和阴沟肠杆菌E-26（Entcobacter cloacae）接种水稻幼苗，在不加碳源时，不论单独或混合接种菌都能在水稻根际正常生长和固氮，如添加碳源，则固氮量剧增。

王子芳等对水稻根际固氮细菌的生态与分布进行了研究，认为水稻根系固氮活性、固氮菌株比例与水稻生育期关系密切，一般是抽穗期最高，成熟期最低。

尤崇杓等通过对水稻根分泌物及其与粪产碱菌的相互作用研究，认为联合固氮细菌能刺激宿主植物分泌更多的有机物，接种粪产碱菌能提高根际溶液的激素水平。

林敏等在接种联合固氮细菌的水稻植株根际测到植物生长素和玉米素含量各为144ug/g和15ug/g，而对照植株内根际仅测到生长素含量为63.3ug/g。

丘明祺等研究了催娩克氏菌（Klebsilla oxytoca）的不同菌株（耐氨固氮型、野生型、不固氮型）对水稻秧苗生长的影响，发现耐氨固氮菌可分泌某种植物生长促进物质，这种物质可使水稻秧苗的根重和苗重增加30％。

Konish等证明了在不施氮肥的水稻田中，联合固氮菌每年从空气中固定的氮至少为20kg/hm2；Burn和Hardy则估计为30 kg/hm2；Wetsdarr则认为是49 kg/hm2。

莫文英测得每季水稻根际的固氮能力为：早稻N 3.00-3.45
kg/(hm2.66d),晚稻N4.50-6.00 kg/(hm2.72d),其中早稻固定的氮素有80%-90%是在抽穗期到成熟期间固定的，而晚稻在此期间只有40%-50%。

15N标记试验表明，在水稻根际所固定的氮在69h内1/3为水稻所利用。

吴文礼等从水稻种子内分离出具有联合固氮作用的内生细菌，即周毛德克斯氏菌(Derxia peritricha)。

海伟力等从我国南方水稻根部分离到3株氧化型革兰氏阴性细菌，并对其特性进行了研究。

崔宗均等从黑龙江、宁夏等水稻田中分离到18株固氮菌，并从形态、生理、生化特征上进行了菌种鉴定，为水稻固氮菌的进一步研究和固氮菌剂的开发和研制提供了基础资料。

李艳琴等通过三亲交配的方法，把带有梨活疫欧文氏杆菌（Erwinia amylovora）基因簇的重组粘pcpp430接合转入催娩克氏菌中，构建成工程菌。

该工程菌是一种既能固氮又能诱导植物抗病的工程菌，它的成功构建为研制新型生物肥料和生物农药探索了一条新途径。

1.2.3.2 小麦
有关小麦联合固氮作用的研究也很多。

如Bilal等通过对5个小麦品种根际固氮菌种群随季节变化的研究认为，根内固氮菌的数量比根表多，成熟期比分蘖期高。

Boddey等的试验表明，巴西固氮螺菌在小麦上的固氮量占植株吸收总氮量的12.6%-38.0%。

在英国Broodbalk小麦连续接种试验中，1843－1967年进行了氮素平衡研究，结果表明，土壤中每年增加N34 kg/hm2.。

分析美国俄勒冈小麦土样所得结果是N2 g/(hm2.d)。

在巴西里约热内卢小麦土样分析表明，固氮酶的活性很高，N为38-506 g/(hm2.d)。

在黑龙江省的气候条件下，春小麦联合固氮量年平均为7.5-15.0 kg/hm2.。

1.2.3.3 玉米
湖北省微生物研究所生物固氮组从武汉市和南宁市玉米根系上分离出一批具有固氮酶活的菌株，并对其进行了鉴定和特性的研究，其为含脂刚螺菌（Spirillum lipoferum）。

经盆栽回接试验证实，其固氮酶活可达600-1000 nmolC2H2/(g干根.h),如不加诱导则测不出酶活性。

张宏等对玉米根部的固氮活力和固氮部位进行了研究，认为其固氮活力在0.04-29.3 kg/hm2.，固氮部位在根系的各部。

Rao等认为玉米种子和根系的分泌物对联合固氮菌具有选择性影响。

李永兴等从四川省灌县地区的玉米根际分离到一株发酵型细菌，经鉴定为日勾维肠杆菌（Enterobacter gergovia）,其最适生长温度为30℃，pH为8.0。

Carcia等认为玉米品种对固氮螺菌也表现出不同的接种效应。

隋文志等研究玉米品种和氮肥对耐铵型玉米联合固氮菌（E-7）接种效应表明，接种E-7能刺激玉米分根，使根系条数增加。

1.2.3.4 甘蔗
甘蔗联合固氮菌的研究很受关注。

Zafar等研究了巴基斯坦甘蔗根际固氮酶的活性认为，其根际存在着固氮活性较高的菌株，清洗的根和未清洗的根其固氮酶活性分别为11-257 nmol C2H2/(g干根.h)和11－631 nmolC2H2/(g干根.h)，而且10-12月其值较高。

Dobereiner实验室从甘蔗根茎中分离到一种新的耐酸固氮菌“重氮营养醋杆菌”(Acetobaoter diazotrophicus)。

研究表明
该菌具有很强的宿主专一性，不仅可固氮而且可以直接作用于植物的代谢，从而促进植物生根和植物生长。

Bilal等从巴基斯坦一种生长在贫瘠盐碱淹水土壤中生长很茂盛的先锋植物“卡拉草（Leptochloa fudca）”中分离到一种固氮弧菌（Azoarcus sp.），该菌在干根内数量可达1x108个/g。

1.2.3.5 谷子
刘荣昌等从谷子根系样品中分离到固氮酶活性较高的4株细菌M-Ⅱ-1222、M-Ⅱ-931、M-Ⅰ-1021、M-Ⅰ-94。

经鉴定，前3株菌属于土生克雷氏杆菌（Klebsiella terrigena）。

同时，将这4株菌分别配制成液体菌剂，回接谷子。

结果表明，均能促进谷子生长发育。

1.2.3.6 竹子
在竹类植物根际也存在着联合固氮体系。

顾小平等对毛竹（Phyllostachys heterocyclavar. Pubescens(Mazel) Ohwi）和浙江淡竹（Ph. Meyeri McClure）根际联合固氮的研究，采用划线法在浙江淡竹根际分离到3株具有较高活性的固氮菌，经鉴定G-4属肺炎克雷氏菌（Klebsiella pnumoniae）,这是首次发现竹类植物根际也存在着联合固氮菌。

之后对几丛竹根际的研究表明，充足的水分供应，较高的温度及适当的施用有机肥有利于竹子固氮，在根际不同部位，固氮菌数为根内＞根表＞根际土＞非根际土。

接种从毛竹根际分离的菌株显示其可以不同程度的提高毛竹幼苗的成活率并促进其生长，尤其对根的鲜质量增加明显。

同时，还可以明显提高苗木体内的氮素含量，增幅可达22.0%-38.1%。

1.2.3.7木本植物
在木本植物根际也存在着联合固氮作用。

康丽华对桉树（Eucalyptus）联合固氮菌－催娩可氏菌（Klebsiela oxytoca）的研究表明，该菌不但可以在桉树根表定殖，而且可以进入根内。

接种联合固氮菌能刺激桉树根系的分泌作用，对根系分泌物氨基酸、糖及激素的含量有影响，该菌对桉树的生长有明显的促进作用。

赵秀云等在杨树（Populus）3个不同地点的21个杨树无性系及半同胞家系根际和不同部位分离到的固氮菌与禾本科植物根系分离的一些联合固氮菌类群基本一致。

1.2.4 联合固氮作用的影响因素
1.2.4.1 内在影响因素
1) 能源能源是主要的限制因素。

植物光合作用的强度影响其根际的固氮活性。

在植物生长发育旺盛期，约有1/3的光合产物以根分泌物和脱落物形式进入土壤，这些含碳物质便可以成为联合固氮菌的能源。

2) 植物遗传类型植物的不同基因型其联合固氮体系的固氮酶活性有差异。

如水稻的栽培型就较野生型的固氮活性强。

Komagata认为植物与固氮菌的联合由植物基因型控制，并经驯化而得到加强。

生态型亦影响固氮菌与植物的联合，如雀稗固氮菌只能与五种四倍体生态型联合。

不
同生理型植物则C4植物较C3植物更有利于根系固氮作用，但水稻除外。

1.2.4.2 环境因素
1) 营养状况植物根际的固氮活性由季节和昼夜的变化。

如紫狼尾草根系固氮活性在夏季植物迅速生长时最高，在开花后下降。

玉米根固氮活性最高时是在75％吐丝期，也即在繁殖阶段，高梁也一样。

水稻在抽穗期活性最高，然后迅速下降。

玉米固氮活性的昼夜变化一般呈两个高峰，一个高峰出现在中午，第二个高峰在晚上。

水稻则只在白天9－10时有一个高峰。

2)光强无论是实验室还是田间实验都表明，植物吸收光能与固氮活性间呈线性关系。

3) 温度气温的影响主要反映在植物的光合作用进程和同化产物的运输速度上。

当气温低于19℃时，固氮活性不高。

土温影响固氮菌的发育，固氮螺菌的最佳温度为32－40℃，低于18℃时，则对温度较敏感(Balandreau et al., 1980)。

4)湿度 空气湿度影响叶片气孔和向上运输从而影响将所固定的氮运向植物。

土壤水分也有很大影响。

5)氧的水平联合固氮菌细胞内多有不同的氧保护机构。

产脂固氮螺菌在氧分压为1013.25-5066.25 Pa时具有最高的固氮酶活性。

6) 其他 在环境因子中，根际土壤中无机氮的浓度及土壤pH值等因素也影响固氮酶的活性。

罗孝杨等已诱变出可耐75mM NH4+高铵的固氮螺菌突变株。

1.2.5联合固氮作用展望
联合固氮作用是一新的领域，国内外学者都在努力，以进一步揭示联合固氮的奥秘并加以利用。

目前人们正从以下几方面加紧研究联合固氮作用：（1）谷类作物根部联合固氮菌的定位观察。

（2）固氮能源的供给和组成。

（3）联合固氮菌的鉴定。

（4）气体交换量，氮和碳源的转运及其比率。

（5）植物与联合固氮菌的亲和性测定。

不同植物具有不同的联合固氮菌组成，各种联合固氮菌也只与一定的植物联合固氮。

（6）影响联合固氮菌生存的生态因素。

在众多土壤环境条件下，结合态氮是抑制其固定大气氮的重要因素。

如何获得在高浓度结合态氮下仍能固定大气氮并向植物泌铵的菌株是当今的研究热点，也是生产中极有价值的项目。

（7）不同体系中的固氮量。

不同体系固氮量相差很大，可以选择高固氮量的体系直接加以应用。

（8）联合固氮菌之间的相互关系及其协同作用。

有些植物同时存在多种联合固氮菌与其联合。

此项研究有利于更好的选择和配备不同的菌株，以使它们发挥最佳的接种效应。

（9）除固氮外是否还有其它激素作用。

有些联合固氮菌在固氮的同时还可以向植物分泌生物活性物质。

研究这些活性物质的种类和作用是有价值的。

（10）接种技术与大面积田间示范、推广。

研究如何将所选的菌株接种到未带菌的植株上将是在生产上大量运用时首先要解决的问题。

对于木本植物，有人认为可在育苗中进行，即培育出根部带固氮菌的“固氮菌苗”用于造林。

（11）高固氮效率的遗传工程菌的获得和田间释放效果。

此类研究已深入到基因水平。

甚至有人设想把固氮菌的固氮基因直接导入到植物叶绿体或线粒体中，以获得自主固氮的植物。

虽然联合固氮的固氮效应不及共生固氮高，但其分布广，受益作物多，因而是一类不可忽视的固氮体系。

它们在提供土壤和作物氮素方面的作用，尤其是能补偿少施部分氮肥的效果，对缓。