普鲁兰酶产生菌的筛选及部分酶学性质研究

普鲁兰酶产生菌的筛选及部分酶学性质研究
摘要利用选择性培养基从淀粉加工厂附近土壤中分离出11株具有产普鲁兰酶能力的菌株，对其中产酶能力最高的PB1菌株所产酶进行了性质测定。

结果显示：PB1所产普鲁兰酶活力为3.25U/mL；该酶最适反应温度为60℃，在低于70℃范围内热稳定性较好；最适反应pH值为5.0~6.0，在pH值为4.0~7.5范围内稳定；Fe3+对该酶活性有明显的促进作用，而Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+对该酶活性有强烈的抑制作用。

关键词普鲁兰酶；筛选；酶学性质
普鲁兰酶（Pullulanase，EC3.2.1.41）是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶[1]。

在淀粉加工行业中，由于大部分淀粉质原料支链淀粉含量约为70%~95%，支链淀粉不被分解则影响到淀粉的利用率和产品的质量。

普鲁兰酶能水解α-1，6-糖苷键，可以显著提高淀粉原料的利用率，从而提高生产效率。

目前已经较成功地应用于高葡萄糖浆、高麦芽糖浆、低聚寡糖浆和啤酒生产[2]。

普鲁兰酶由于来源不同，酶性质差异较大。

在淀粉的加工行业上，普鲁兰酶多与α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等其他淀粉酶类配合使用，必须满足其他淀粉酶类的反应条件，因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热[3，4]。

普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌（Aerobacter.aerogenes）发酵获得[5]。

他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入地研究，从不同地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。

尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件（酸性，高温），大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。

目前，我国只局限于实验室研究且酶活较低，工业上所用的普鲁兰酶均是从丹麦NOVO进口[6]。

本研究通过初步的筛选工作，得到了1株产普鲁兰酶较好的菌株。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1土样。

从淀粉加工厂附近取土样。

1.1.2试剂和仪器。

普鲁兰糖（购自日本林原研究所），3，5-二硝基水杨酸（国药集团化学试剂有限公司），糯米淀粉（购于市场）。

DHP-9052型电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），HQ45Z恒温摇床（武汉中科科仪技术发展有限公司），GL-12B型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），722S分光光度计（上海棱光技术有限公司），SW-CJ-ZD超净工作台（苏州净化设备有限公司），YX280A高压蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）。

1.1.3培养基。

平板分离培养基：普鲁兰糖0.3%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.01%，琼脂
2.0%，pH值为5.0。

斜面培养基：糯米淀粉1.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.01%，琼脂2.0%，pH值为5.0。

液体培养基：糯米淀粉2.0%，蛋白胨1.0%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.05%，硫酸铁0.001%，pH值为5.0。

1.2方法
1.2.1菌种筛选方法。

（1）普鲁兰酶产生菌的初筛。

取10g土样加入到装有90 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡30min，使样品充分打散后，吸取1.0mL于富集培养基中，在35℃下振荡培养48h。

取培养液稀释涂布于以普鲁兰糖为唯一碳源的平板分离培养基上，35℃温箱中培养48h。

将平板倒置，注入10mL无水乙醇，室温放置24h，观察菌落并挑出周围出现透明圈的菌落，于斜面培养基上进行培养。

（2）菌种纯化。

用接种环从斜面培养基上挑取少量菌株接入平板固体培养基，采用平板划线分离法对菌株进行纯化，将产生透明圈的单菌落接入斜面培养基，供菌种复筛用。

（3）摇瓶培养法复筛。

将斜面保存的菌种接入种子培养基中，35℃振荡培养24h后，制得菌悬液，将菌悬液以4%接种量接入菌种筛选摇瓶培养基，35℃振荡培养48h后，测定发酵液中普鲁兰酶活力。

1.2.2普鲁兰酶液的制取。

摇瓶振荡培养后，收集发酵液，5 000r/min低温离心后取上清液，制得粗酶液。

1.2.3普鲁兰酶活力测定。

采用3，5-二硝基水杨酸法，在1.0mL的5g/L普鲁兰糖溶液（用醋酸缓冲液配制）中加入1.0mLpH值为6.0的醋酸缓冲液，然后加入1.0mL适当稀释的酶液，于60℃保温反应30min，沸水浴10min灭酶，加入3，5-二硝基水杨酸1.5mL，沸水浴10min，取出冷却，于520nm处测光吸收值。

酶活单位定义为在上述条件下，每分钟催化分解普鲁兰糖生成相当于1μmoL葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个酶活单位。

1.2.4普鲁兰酶的部分酶学性质。

（1）最适温度及热稳定性。

将普鲁兰酶液分别于不同温度下测其活力，以活力最高者为100%对照，测试其最适反应温度。

在不同温度下，将普鲁兰酶液分别保温1h后，测定残余酶活力，以活力最高者为100%对照，试验温度对普鲁兰酶稳定性的影响。

（2）最适pH值及pH值稳定性。

将普鲁兰酶液分别于不同pH值下测其活力，以活力最高者为100%对照，测试其最适反应pH值。

将普鲁兰酶液在不同pH值缓冲液中于室温保持24h后，测定残余酶活力，以活力最高者为100%对照，试验pH值对普鲁兰酶稳定性的影响。

（3）金属离子对普鲁兰酶活性的影响。

将不同的无机盐溶液与等量普鲁兰酶液混合，并使混合液中的无机盐最终浓度达到0.5mmoL/L，按1.2.3的方法测定酶活力，设不加金属离子组为对照组，测定金属离子对普鲁兰酶活力的影响。

2结果与分析
2.1菌种的分离筛选
从采集到的土样中，通过平板分离筛选，共筛选到有较明显透明圈菌株35株，摇瓶培养复筛后，经酶活测定比较，其中11株产酶能力较高，其透明圈与菌落直径比值、酶活力见表1。

其中以编号PB1的菌株产酶活性最高，因此选PB1为进一步试验用菌。

2.2普鲁兰酶的部分酶学性质
2.2.1最适温度及热稳定性。

温度对普鲁兰酶活性的影响见图1。

由图1可以看出，不同温度对普鲁兰酶分解普鲁兰糖具有明显的影响，该酶在55~65℃范围内活性较强，其中60℃为其降解普鲁兰糖的最适温度。

普鲁兰酶在低于70℃时稳定性较好，残余活力在90%以上，温度高于70℃后，酶活力开始迅速下降。

2.2.2最适pH值及pH值稳定性。

pH值对普鲁兰酶活性的影响见图2。

由图2可知，该酶的最适pH值为5.0~6.0。

在pH值4.0~7.5范围内，普鲁兰酶稳定性较高，活力损失较少，酶的残余活力在90%以上。

2.2.3金属离子对普鲁兰酶活性的影响。

不同金属离子对普鲁兰酶活力的影响见表2。

由表2可以看出，Fe3+对普鲁兰酶活性有激活作用，而Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+对该酶活性有强烈的抑制作用，Zn2+、Mg2+、Ni2+也有一定的抑制作用，其他金属离子对该酶活性影响不明显。

3讨论
本试验中普鲁兰酶产生菌是从淀粉加工厂附近土壤中筛选得到，其初始产酶能力较高，但还需对其产酶条件进行优化，以及采用诱变、基因工程等手段进行选育。

耐热和耐酸性是评价一种普鲁兰酶优劣的重要指标。

各国科研人员从不同地区的微生物中获得了该酶，但很多因其性质不满足当今淀粉加工业生产条件的要求，而得不到广泛地应用。

本文研究了该酶的部分性质，发现该酶的最适反应温度为60℃，在低于70℃范围内热稳定性较好，表明其是一种耐热的酶。

最适反应pH值为5.0~6.0，在pH值4.0~7.5范围内较稳定。

这些特点接近目前淀粉加工的生产条件，对于工业应用是很有利的。

4参考文献
[1] NAIR S U，SINGHAL R S，KAMAT M Y.Induction of pullulanase production in Bacillus cereus FDTA-13[J].Bioresource Technol，1998（4）：856-859.
[2] 吴艳萍，金其荣，李迅.微生物法生产普鲁兰酶的研究[J].生物技术，1998，8（6）：14-17.
[3] DOMAON-PYTKA M.Pullulan degrading enzymes of bacterial origin[J].Crit RevMicrobiol，2004（30）：107-121.
[4] 唐宝英，朱晓慧，刘佳.耐酸耐热普鲁兰酶菌株的筛选及发酵条件的研究[J].微生物学通报，2001，28（1）：39-43.
[5] 陆健，金冲，顾国贤.普鲁兰酶及其生产菌种[J].酿酒，1998（5）：1-6.
[6] 闵伟红，刘艳，沈淑杰，等.普鲁兰酶产生菌的筛选及诱变技术研究[J].吉林农业大学学报，2007，29（3）：343-346.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。

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