高效液相色谱在医学中的应用

内容
高效液相的基本知识 液相色谱在医学科研中的应用
效液相色谱对药物的分析测定
液相色谱在临床医学中的应用
展望
什么是高效液相色谱
高效液相色谱法 (High performance liquid chromatography) 简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高 效能分离手段： – 高性能的色谱柱，高精密度、耐高压的输液泵
HPLC在医学科研中的应用
对DNA的分析测定
随着分子遗传学的不断发展及各种 新技术的广泛应用，细菌的分类鉴定已 从传统的表型特征描述深入到各种细菌 细胞成分的化学分析和分子遗传学鉴定。 DNA是生物体的主要遗传物质，因而是 物种分类鉴定的重要依据。
现在, 色谱法已用于生物碱基的测定, 其 中以反相高效液相色谱法应用较多. 采用高 效液相色谱法测定DNA碱基组成, 可以给出 精确的G+ C 摩尔百分含量
对生物体液中药物对映体的分离分 析，有利于了解各种对映体的药代动力 学、体内代谢过程和生物利用度。但由 于对映体的物理、化学性质相同，实现 它们的分离就比较困难，如大多数氨基 酸都有左旋体和右旋体，但往往只能获 得右旋体和左旋体的混合物。
手性试剂衍生化法是将对映体经手 性试剂衍生，生成非对映异构体后，利 用常规HPLC 方法进行分离和测定。适 用于不宜直接拆分测定的化合物如手性 脂肪胺类、醇类等。目前, HPLC 是在手 性药物拆分中应用最多的方法之一。
数
色谱泵
据
处
理
自动进样器
系
统 色谱柱及柱温箱
检测器
Agilent 1100 system
流动相
托盘 脱气机
色谱泵
数
据
自动进样器
处
理
系
色谱柱及柱温箱
统
检测器
DAD检测器检测的三维图谱
Spectral Acquisition Modes All spectra Every 2nd spectrum All in peak Baseline plus 3 in peak Apex only
效液相色谱对药物的分析测定
1.在手性药物中的应用 2.在抗生素中的应用 3.在合成药物中的应用 4.在天然药物中的应用
在手性药物中的应用
在生物体内，几乎所有具有重要生理 活性的有机生物分子都有手性(chirality) 。 两种化学组成、分子式完全相同的化合物， 但因组成化合物的原子在空间取向不同， 而成为镜像的化合物，称为手性化合物。
对激素的分析测定
肾上腺皮质激素是中性和非极性物质。 色谱柱为硅胶柱，流动相多用二氯甲烷， 乙醇和水溶液进行梯度洗脱，可于50分 钟内同时测13种肾上腺皮质激素。如： 脱氧皮质酮，肾上腺雄酮和地塞米松等。
目前也有在正相分析分离后用放免 测定方法定量。色谱柱为Dio1250×4.6毫 米，流动相为正已烷和异丙醇，梯度洗 脱这种方法灵敏度较高，只需1毫升血清 样本就能同时分析15种激素。如：孕酮 和考的松等。这些方法为人体的激素合 成障碍和一些内分泌疾病的诊治提供了 精确的生化诊断方法。
Absorbance
液相色谱在学科研中的应用
近几年来，随着各种高效液相 色谱柱的出现和多元溶剂梯度洗脱 的完善，分析的灵敏度明显提高。 HPLC已经成为并将继续作为医学 领域研究工作中的非常有效的仪器 分析方法之一。
液相色谱在医学科研中的应用
1. 对DNA的分析测定 2. 对蛋白质的分析测定 3. 对氨基酸的分析测定 4. 对激素的分析测定 5. 对神经递质的单胺类的测定 6. 对同工酶的分析检测
对胺类的分析测定
研究中枢神经系统功能的工作要求 能够测定作为神经递质的单胺，前 体氨基酸及其代谢产物。
HPLC辅以电化学监测器可同时测定 茶酚胺，吲哚胺，其前体氨基酸和代谢 产物。如肾上腺素，多巴胺，铬氨酸，5 羟色胺，5羟吲哚乙酸，色氨酸等共计20 多种。分析方法还可以自动化，30分钟 内同时测定14种与儿茶酚和吲哚胺代谢 有关的物质，其灵敏度为500fmol。
苯丙酮尿症（PKU）的检测方法有荧 光分析法、细菌抑制法、生物敏感电极 法等。荧光分析法需配套仪器和试剂， 单个标本仍需2-4h。细菌抑制法仅为半 定量，其正确性受多种因素影响，费时 长，需过夜培养。生物敏感电极法操作 简便，但结果欠准确。
HPLC法利用苯丙氨酸具有紫外吸收 的特点，血清标本去蛋白后取上清进样 经色谱柱分离后进行检测，进样5min即 可分析完毕，所需试剂种类少，来源方 便，配制简单，线性范围宽，精密度高， 重复性好，用血量少，简便快速，适合 临床使用。
血红蛋白是由血红素和珠蛋白结合而成。 以往用电泳法可发现六种组分，用HPLC法 可发现更多组分，其中一些小峰为糖基化血 红蛋白。如：测定HbAc(糖基化血红蛋白的 主要产物 )可反应糖尿病的病情控制情况， 比血糖和糖耐量实验更为敏感。
例3 氨甲酰化血红蛋白的测定
氨甲酰化血红蛋白(CHb)为血液中的 尿素在红细胞中分解代谢, 与血红蛋白加 成反应而形成的产物。CHb在红细胞中 不断形成、堆积，伴随红细胞寿命的全 过程，反映血液中尿素在一段时间的平 均水平。对肾功能衰竭患者的诊断，治 疗监测及病理生理学研究有重要价值。
对同工酶的分析检测
由于近年来HPLC色谱柱对水溶性的高 分子物质吸附很少，同时又具有高度的 分离效能，因此已被用于乳酸脱氢酶， 肌酸磷酸激酶，亮氨酶氨基肽酶等多种 同工酶的测定。
测定同工酶时可用阴离子交换色 谱柱，或用凝胶渗透色谱柱，洗脱液 可选用三羟甲基胺基甲烷-盐酸缓冲 溶液和氯化钠液，梯度洗脱，在20分 钟的分析中测出碱性磷酸酶有3个组 分。亮氨酸氨基态酶有4个组分，r谷氨酰肽酶有4个组分。
有实验对30 名尿毒症和血液透析患 者及10 名肾移植患者的血液测定。以反 相高效液相色谱法定量测定血液氨甲酰 化血红蛋白的酸水解产物缬氨酸乙内酰 脲。该法快速、敏感、特异，可作为肾 功能衰竭病人的诊断和治疗监测指标。
肾移植后肾功能改善者CHb变化
对氨基酸的分析测定
氨基酸在生物体内的含氮物质的代 谢，蛋白质的合成和更新中占重要 地位，近年来采用HPLC分析氨基酸 的报告日渐增多。
HPLC在临床中的应用
人体在正常生理或病理条件下 产生的许多内源代谢物都可用HPLC 法分析。通过对这些物质的监测， 为生理研究、临床诊断和疗效观察 提供宝贵的依据。
例1 苯丙酮尿症
苯丙酮尿症(PKU)是一种较常见的以 智力发育不全为主要特征的遗传代谢性 疾病。HPLC法因为灵敏度高，特异性强， 2000年全国儿科内分泌遗传性疾病会议 上被肯定为早期诊断，防治高苯丙氨酸 血症的新的有效方法。
高效液相色谱 在医学中的应用
上海交通大学附属第一人民医 胡道德
教师简介
贴照片处
（照片尺寸9.4×6.8cm）
现工作于上海交通大学附属第一人民 医院临床药学科，博士学位，硕士研 究生导师。先后毕业于中国药科大学、 复旦大学、上海交通大学。主要从事 药学临床、科研和教学工作。
胡道德 教授
胡道德教授先后承担多项科研项目， 发表国内外科研论文30余篇，培养硕 士生多名，获国家发明专利3项。
以及高灵敏度的检测器…… 广泛应用于各个领域：
– 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……
高效液相色谱法的特点
分离效能高 选择性高 检测灵敏度高 分析速度快
高效液相色谱法的分类
吸附色谱 分配色谱 离子色谱 体积排阻色谱 亲和色谱
HPLC的仪器配置及流程
流动相
Turnell 报道用HPLC法可在40分钟 内同时测定31种氨基酸（包括三个内标 物），分析方法回收率平均为101％±2.3 ％（SD），分析氨基酸的检测限可达38f mol，用于分析血清及尿液中的氨基酸含 量，其结果较为理想。
另有报道采用Zorbax C8高效柱分析 氨基酸衍生物，所用流动相为甲醇，醋 酸钾缓冲溶液和少量四氢呋喃，梯度洗 脱，可于15分钟内同时分离和测定20种 标准氨基酸的磷苯二甲酸衍生物。 HPLC分析氨基酸还可用异硫氰酸苯酯 衍生法和丹磺酰衍生法，但这两种方法 的反应步骤较为复杂，干扰因素较多。
例2 牙周病
维生素K是牙周产黑素厌氧菌生长的 必需因子。以冲洗法采集龈沟液样本，用 HPLC检测成人牙周炎患者与正常对照组维 生素K1的平均值，发现两者维生素K1水平 有显著差异，提示炎症部位维生素K可能 是牙周产黑色素厌氧菌生长的营养因子。
展望
目前 ， HPLC技术飞速发展，已成 为一种常规的应用技术。HPLC技术主用 于有关医学科研、临床诊断、天然药物研 究、药物代谢研究、生物复杂物分析等医 学领域，逐渐扩展到生物大分子、环境卫 生等相关生命科学领域。定量测定、筛选 和鉴定靶向生物成分以及未知代谢物等分 析应用，这将进一步推动HPLC技术的发 展。
在抗生素中的应用
近年来，HPLC在抗生素中的应 用也比较广泛。绝大多数新增品种 的抗生素在鉴别项中都选用了HPLC 法, 如新增的喹诺酮类品种和头孢菌 素类品种。
在合成药物中的应用
在合成药物中高效液相色谱法的 应用主要是在杂质检查，以及复方 制剂的含量测定。
在天然药物中的应用
天然药物的化学成分比较复杂， 有效成分可能有多个。HPLC在中 药研究中的应用主要在标准品的制 备与样品的分离纯化方面。通过对 天然药物的有效成分进行分离鉴定， 再测定有效成分的含量。
在选定的色谱条件下，将各碱基标准品 混合进样，将DNA 样品酸解溶液平行进样。
对蛋白质的分析测定 根据蛋白质的基本性质，如分子量大小， 电荷性，亲水性程度和生物亲和性。可 选用凝胶过滤或渗透色谱，阳离子或阴 离子交换色谱，反相色谱和亲和色谱。 用HPLC分析蛋白质的的速度比经典的 方法快十倍以上。
谢谢大家！
例1 两歧双歧杆菌DNA G+ C 摩 尔百分含量的测定
有报道从健康男性青年粪便中分离 到人双歧杆菌株,提取DNA,在一定条件下 使DNA水解，用氢氧化钠溶液调pH后用 水定容，离心后取上清液供分析。分别 取该溶液和标准碱基混合液注入色谱柱。
例2
大鼠肝组织中
DNA 的碱基含量的测定
采用Supelcosil LC218 色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)，以甲醇:0.05 mol/L KH2PO4缓冲液(20∶80) 为流动 相，流速0.8 ml/ min，对生活在高原的 习服大鼠肝组织中DNA的碱基含量进 行了检测。