泡盛曲霉CAU33固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵条件优化

泡盛曲霉CAU33固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵条件
优化
刘二伟;刘学强;杨绍青;江正强
【摘要】利用单因素实验法优化了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CAU33利用
农业废弃物固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件.产酶的条件包括碳源种类、初始水分含量、氮源种类、初始pH、表面活性剂、培养温度和发酵时间.进一步运用响应面分析法优化了其中主要因素,得到最佳产酶条件为:啤酒糟为碳源、含水量
为81.6%、吐温60添加量20g/L、大豆蛋白胨添加量25g/L、自然pH、35℃下培养6d.在优化后的发酵条件下,最大产酶水平达到40832.9U/g.泡盛曲霉固体发
酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力高,工业化生产和应用潜力大.%The fermentation conditions f or β-1,3-1,4-glucanase production from Aspergillus awamori CAU33 by solid state fermentation(SSF)with agricultural wastes as carbon source were optimized. Seven factors including carbon source, initial moisture content, nitrogen source, initial pH, surfactant source, temperature and fermentation time were optimized by single-factor experiment firstly, and the major factors amongst were then optimized by response surface method. The optimal fermentation conditions for β-1,3-1,4-glucanase production were as follows:beer sludge as carbon source, initial moisture content of 81.6%, Tween 60 of 20g/L, soya peptone content of 25g/L, natural pH, culture temperature of
35℃and culture time of 6d. Under the optimized conditions, the highest β-1,3-1,4-glucanase production of 40832.9U/g was achieved. The high yield may give the enzyme great potential in industrial applications.
【期刊名称】《生物产业技术》
【年(卷),期】2018(000)003
【总页数】7页(P80-86)
【关键词】泡盛曲霉;啤酒槽;固体发酵;β-1,3-1,4-葡聚糖酶
【作者】刘二伟;刘学强;杨绍青;江正强
【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083
【正文语种】中文
β-1,3-1,4-葡聚糖是由多于1000个葡萄糖残基以β-1,3和β-1,4混合糖苷键连接而成的直链葡聚糖聚合物，主要存在于谷物的胚乳和细胞壁中。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）是一类重要的水解酶，可以水解谷物中的β-1,3-1,4-葡聚糖，由于其在食品、饲料和纺织等领域的重要应用价值，近年来成为水解酶研究的热点之一。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要由微生物发酵生产，发酵方式以液体发酵为主，固体发酵的相关报道相对较少。

固体发酵（SSF）在生物质处理与开发、有害化合物的生物修复和生物降解、酶和发酵技术领域有广泛的应用前景[1]。

固体发酵可以利用玉米芯、秸秆、酒糟、大麦麸皮、燕麦麸皮、稻谷壳糠、甘蔗渣等农业废弃物为原料进行发酵。

这些农业废弃物来源广泛，可以就地取材，而且价格低廉，同时也可解决农业废弃物丢弃或处理对环境造成的污染[2]。

近年来，利用固体发酵产葡聚糖酶的研究逐渐增多。

Maktouf等[3]研究了固体发酵培养芽孢杆菌UEB-S产β-1,3-1,4-葡聚糖酶，在35℃下培养4.6d，酶活力达
到503U/g干基。

Chaari等[4]以豌豆渣为基质培养地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis UEB CF）产β-1,3-1,4-葡聚糖酶，采用响应面法优化了产酶条件，44℃培养84h，酶活力达到280U/g干基。

Yang等[5]以燕麦粉为基质培养米黑
根毛霉（Rhizomucor miehei）产β-1,3-1,4-葡聚糖酶，优化发酵产酶条件后最
高酶活力达到20 025U/g干基碳源。

笔者研究团队从土壤中筛选到一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌，通过对菌株菌落形态、产孢结构和基因序列的对比鉴定为泡盛曲霉。

本文进一步优化该菌株以农业废弃物为碳源固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件，为后续工业生产和应用提供一定理论依据。

1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
HZQ-F160全温震荡培养箱，太仓实验设备厂；LRH-恒温恒湿培养箱，广东省医疗器械厂；TU-1800PC紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器设备有限责任公司；GL-20B高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；Power Pac Basic TM型电
泳仪，美国BIO-RAD公司；酵母提取物、蛋白胨，英国Oxoid公司；玉米芯、
玉米秆、燕麦粉、稻草秆、麸皮（已粉碎至20～40目），市售；大麦β-葡聚糖、葡萄糖，Sigma公司；其他试剂如无特殊说明均为分析纯。

1.2 孢子悬液制备
泡盛曲霉CAU33在PDA培养基中30℃培养3～6d，待孢子成熟后加入5mL无
菌水（含有2%甘油），用无菌涂布棒轻轻平刮菌落表面，制成孢子悬液，稀释适当倍数使孢子浓度为107个/mL。

1.3 固体发酵产酶及粗酶液提取
称取已烘干碳源5g，放入250mL锥形瓶中，加入7.5mL营养盐溶液，摇晃均匀
后用封口膜密封，121℃灭菌20min。

冷却至室温后接种1.0mL孢子悬液，摇晃
混合均匀后放在30℃恒温恒湿培养箱中静态发酵4d。

营养盐溶液的组成为：
KH2PO4 1.0g/L；MgSO4·7H2O 0.3g/L；CaCl2 0.3g/L；酵母提取物20g/L；
自然pH。

粗酶液提取：发酵4d后以10∶1（mL/g干基）比例向发酵锥形瓶中加入
20mmol/L pH 5.0 乙酸缓冲液，30℃、200r/min振荡提取2h，然后在10
000r/min条件下冷冻离心10min，上清液即为粗酶液。

1.4 泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶发酵条件优化
1.4.1 单因素发酵条件优化
单因素实验法优化泡盛曲霉CAU33固体发酵的产酶条件，包括碳源种类（稻草、玉米芯、小麦麸皮、燕麦麸皮、燕麦粉、青稞粉、白酒糟、啤酒糟、稻谷壳糠、米糠等，初始含水量为60%）、氮源种类［酵母提取物、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨、
胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉蛋白胨、乙酸铵、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4等，初含量为2%］及含量（0～3%）、表面活性剂种类（吐温20、40、60、80，曲拉通110、X114，SDS等，初含量为0.5%）及含量（0.5%～3%）、初始pH值（pH 2～7）、培养温度（20℃～50℃，初始温度30℃）以及发酵时间（1～7d）等对产酶的影响。

以未接种的锥形瓶作为阴性对照，每组实验做3个平行，结果
取平均值。

1.4.2 Plackett-Burman实验设计筛选主效应参数
在单因素实验的基础上，以酶活力值作为响应值，对固体发酵培养基组分的7个
影响因素进行考察评价，筛选出主效应因子，每个因素选两个水平，低水平记为“-1”，高水平记为“+1”，共12组实验。

实验因素及水平取值如表1所示。

表1 Plackett-Burman 实验设计各因素与水平
1.4.3 Box-Behnken Design响应面法实验设计
根据单因素实验结果，选取含水量、吐温60量和培养时间3个因素为自变量，以β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力为响应值，根据单因素实验所得最优条件，以其为中心进行三因素三水平BBD响应面实验（α=1），经软件计算需做17组实验，其中包
括12个分析实验和5个中心实验。

响应面实验数据通过软件多元回归拟合可得回归方程，根据回归方程确定液体发酵的最佳条件。

1.4.4 模型的验证
通过响应面法优化泡盛曲霉产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件，之后以最终优化条件进行固体发酵产酶，根据产酶实际值与预测值的相近程度判断该模型是否建立成功。

1.5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力和蛋白含量的测定
参照Yang等[5]的方法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力：添加50μL 1%（质量浓度）大麦β-葡聚糖于玻璃试管中，55℃预热3min，然后加入150μL适当稀释的酶液，震荡混合均匀，55℃反应10min，再加入200μL DNS试剂终止反应，煮沸
15min显色后加入200μL 40%酒石酸钾钠溶液，振荡混合均匀，冷却后于
540nm波长下测定吸光值，以葡萄糖为标准做标准曲线。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶活
力单位（U）的定义为：在上述条件下每分钟催化大麦β-葡聚糖产生1μmol葡萄糖所需要的酶量。

蛋白含量测定参照Lowry等[6]的方法，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。

1.6 SDS-PAGE电泳及酶谱分析
SDS-PAGE参照Laemmli[7]的方法：分离胶浓度12.5%，浓缩胶浓度4.5%，用
考马斯亮蓝R-250染色。

酶谱分析按照Yang等[5]的方法：在正常的SDS-PAGE 电泳分离胶中添加大麦β-葡聚糖溶液，使终浓度为1‰～2‰，即为酶谱分析胶，电泳结束后，将酶谱分析胶取出用25% 的异丙醇浸泡3次，每次15min，然后将电泳胶用20mmol/L pH 5.0乙酸缓冲液漂洗3次，每次10min，55℃保温
30min后用0.5g/L的刚果红溶液染色10min，再用1mol/L氯化钠溶液脱色2～
3次，每次10min，最后用0.5%乙酸定色并拍照。

2 结果与讨论
2.1 泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶单因素实验结果
2.1.1 碳源及含水量对泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶的影响
研究不同碳源对泡盛曲霉CAU33发酵产酶的影响，结果显示以啤酒糟为碳源时酶活力最高，为9177U/g，其次是小麦麸皮（6588U/g）和玉米秆（5228U/g）（表2）。

因此，确定啤酒糟为最优碳源。

进一步研究含水量对菌株发酵产酶的影响（啤酒糟为碳源）。

结果表明，初始含水量为80%时酶活力最高，为15 288U/g，而当初始含水量升高至85%时酶活力下降为12 236U/g，降低至75%时产酶水平下降为14 155U/g。

因此，选择80%
的初始含水量作
表2 不同碳源对泡盛曲霉 CAU33固体发酵产酶的影响碳源种类酶活力/（U/g）玉米芯2308±80燕麦麸皮4254±84玉米秆5228±180小麦麸皮6588±192
稻谷壳糠2774±143稻草206±42麦秆2619±56啤酒酒糟9177±269米糠389±40
为最优含水量。

2.1.2 氮源对泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶的影响
氮源提供机体生长发育所需要的氮元素，所以氮源的种类和性质也会影响酶的生成。

实验以啤酒糟为碳源，研究了添加不同种类氮源（2%，质量浓度）对发酵产酶的
影响。

结果表明，有机氮源对促进该菌株产酶的效果优于无机氮源，当以大豆蛋白胨为氮源时，酶活力最高达21 286U/g，而无机氮源的酶活力相对较低（表3）。

表3 不同氮源对泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶的影响氮源种类酶活力/（U/g）酵母提取物15 314±340蛋白胨19 215±232大豆蛋白胨21 286±343鱼蛋白
胨18 082±242 NH4Cl 15 865±278（NH4）2HPO4 16 673±304（NH4）2SO4 14 427±243
进一步研究了大豆蛋白胨含量对泡盛曲霉CAU33发酵产酶的影响。

结果表明，随着大豆蛋白胨含量的增加，酶活力也不断增长，当其含量达到2.5%时，酶活力最高为23 780U/g，再增加氮源含量时酶活力开始下降。

2.1.3 表面活性剂对泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶的影响
在已优化条件的基础上，继续研究了不同表面活性剂（吐温、曲拉通、SDS等，添加量为1%）对泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶的影响。

从表4可看出，SDS对其发酵产酶没有明显作用，而曲拉通对其有一定的抑制作用，吐温对其分泌胞外酶有很大的作用，尤其是吐温60，会明显增加其分泌胞外酶，酶活力最高为31 163U/g。

进一步研究吐温60添加量对酶活力的影响，结果表明，随着吐温60含量的增加，酶活力也在逐渐增长，当浓度达到1%时，酶活力达到最大为31
018U/g，再增加其浓度时对酶活力的增长效果不明显，反而会降低其活力。

表4 不同表面活性剂对泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶的影响表面活性剂种类酶活力/（U/g）无23 630±372吐温20 25 823±370吐温40 27 907±358吐温60 31 163±301吐温80 20 550±350曲拉通110 21 760±321曲拉通X-114 21 295±261 SDS 23 378±109
2.1.4 初始pH对泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶的影响
研究了不同初始pH对其固体发酵产酶的影响，初始pH用1mol/L HCl和NaOH 进行调节。

结果显示，初始pH为5.5时，固体发酵酶活力最高，达到了31 823U/g干基碳源，与发酵初始自然pH（酶活力为31 480U/g）没有差别，而在pH为7时酶活力下降明显，说明该菌株在偏酸性条件下更适宜生长分泌β-葡聚糖酶，所以选择初始自然pH为最佳初始pH。

2.1.5 发酵温度对泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶的影响
固体发酵温度为35℃时，酶活力达到最高为34 422U/g。

当培养温度升至40℃时，酶活力降低至10 432U/g，不到最高酶活力的30%。

培养温度继续升至50℃时菌体未生长，由此可看出泡盛曲霉CAU33是一种中温菌，低温会影响菌体的正常生长发育产酶，因此选择35℃为最佳发酵温度。

2.1.6 发酵时间对泡盛曲霉CAU33固体发酵产酶的影响
确定各个发酵因素的最优条件后，在最优的培养条件下研究了发酵时间对其产酶的影响。

从图1（a）可以看出，发酵初始时酶活力增长的很快，呈直线增长，第3d 后酶活力增长速度减缓，第5d达到最高为38 452U/g，此为目前报道的固体发
酵产β-1,3-1,4葡聚糖酶的最高水平。

胞外蛋白分泌量的增长趋势和酶活力的增长趋势相近，在第6d时胞外蛋白分泌量达到最高为25.5 mg/g干基碳源，其蛋白
电泳图见图1（b）。

图1 泡盛曲霉CAU33产酶曲线及蛋白电泳图（M为低分子量标准蛋白，1～7为第1～7d的粗酶液，8为葡聚糖酶谱）
从图1（b）可以看出，固体发酵粗酶液中至少有4条β-1,3-1,4-葡聚糖酶蛋白，分子量大约为27kDa、29kDa、40kDa、50kDa。

目前，关于泡盛曲霉产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的报道较少，而其他相关酶类的报道有很多，如木聚糖酶
（22kDa[8]、27kDa[9]、32kDa[10]等）、β-甘露聚糖酶（42.2kDa[11]）、α-
淀粉酶（70kDa[12]）等。

2.2 泡盛曲霉CAU33固体发酵响应面实验设计结果
2.2.1 Plackett-Burman实验设计结果
实验选用n=12的PB实验设计模块，对含水量（%）、加料量（g）、氮源量
（g/L）、吐温60量（g/L）、初始pH、培养温度（℃）、培养时间（d），这7个待选因素进行评价，筛选出对酶活提高影响较为显著的几个因素。

结果显示，培养时间、含水量和吐温60量，3个因素对酶活力影响显著，故选取此3个因素进
行后续的响应面优化实验。

在后续实验中均选择单因素实验中的最优水平为中心点，具体取值为：培养时间5d、含水量80%、吐温60量10g/L。

2.2.2 回归模型的建立及方差分析
根据单因素实验的结果，选取了以下3个对发酵产酶影响比较显著的因素，分别
为含水量（A）、吐温60量（B）和培养时间（C）。

并以含水量80%、吐温60
量10g/L和培养时间5d为响应面实验的中心实验点，每个因素设置3个水平。

以A、B、C为自变量，以酶活力为响应值，通过软件Design-Expert 8.0设计响
应面实验并进行多元回归分析，回归拟合后的酶活力的预测值Y可表示如下。

Y=38116.8+1918×A+1265.75×B+4291.5×C+1131.5×A×B+988.5×A×C+70 9.75×B×C-10987.1×A2-718.77×B2-5585.77×C2
经分析，该响应面所得回归方程因变量与自变量线性关系明显，线性回归系数值（p＜0.05）呈现极显著性；失拟项系数值（p=0.3028＞0.05）呈现不显著性；
复相关系数R2=97.42%，二次方程的拟合度高，自变量与响应值之间线性关系显著。

以上一系列参数证实该模型预测结果比较准确。

另外，分析回归方程系数显著性检验结果：模型一次项C极显著，B显著，A不显著；二次项A2、C2均为极
显著，B2不显著；交互项AB、AC、BC均不显著。

2.2.3 响应面及等高线图
由回归方程所得到的响应面立体分析图及其等高线图如图2、图3、图4所示，它们分别反映了含水量、吐温60量和培养时间这3个因素的两两交互作用对响应值的影响。

利用Design-Expert 8.0软件进行分析计算得到最优实验参数及相应的酶活力为：含水量81.59%、吐温60量20g/L、培养时间5.92d，相应酶活力为40 061.8U/g。

经过修正，选择啤酒糟含水量81.6%、吐温60量20g/L、培养时间
6d，测定酶活力为40 832.9U/g，与预测值相近，误差为1.9%，验证该模型能较好地预测实际发酵产酶情况，所得模型对实验有指导意义。

图4 培养时间和吐温60添加量交互影响的响应面图（a）和等高线图（b）
3 结论
结合单因素实验和响应面法优化泡盛曲霉CAU33固体发酵培养基的组分和培养条件，得到了最佳发酵产酶培养基：啤酒糟为碳源、含水量81.6%、吐温60量
20g/L、大豆蛋白胨25g/L、自然pH、35℃下培养6d，在优化后的发酵条件下，最大产酶水平达到40 832.9U/g，是目前报道的野生菌株固体发酵产β-1,3-1,4-
葡聚糖酶最高值。

由于本研究中固体发酵采用的碳源主要原料是纤维质原料，生产成本低。

因此，综合考虑生产成本和酶的产量，以泡盛曲霉CAU33作为出发菌株，采用固体发酵的方式生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶非常适合β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化生产。

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