羊膜上皮细胞的生物学特性和骨向分化

羊膜上皮细胞的生物学特性和骨向分化
司家文;郭礼和;沈国芳
【摘要】人羊膜上皮细胞(hAEC)位于羊膜最内层,外侧包绕人羊膜间质细胞(hAMC)和细胞外基质.hAEC具有典型的上皮细胞样形态和超微结构,而hAMC表
现出上皮-间质混合超微结构特征.这些来自于羊膜的特殊干细胞群可表达八聚体4、关键蛋白、氧化还原调节器1和Y染色体性别决定区相关高速泳动族蛋白盒2等
干细胞标志物,可能较成体干细胞具有更高的多向分化潜力.体外骨诱导培养均可促
进hAEC和hAMC的碱性磷酸酶水平增高,1型胶原和骨钙蛋白等成骨标志物表达,细胞外矿化组织增加.最近的研究显示,将羊膜上皮细胞植入动物骨缺损后,可观察到细胞快速广泛地成骨分化,且细胞可在移植部位存活45 d并持续形成新生骨.作为
一类处于胚胎干细胞和成体干细胞过渡阶段的特殊干细胞样细胞,hAEC在颌面部
骨组织再生方面具有潜在的研究和应用价值,值得国内外同行共同探索研究.
【期刊名称】《国际口腔医学杂志》
【年(卷),期】2014(041)005
【总页数】4页(P575-578)
【关键词】羊膜;干细胞;成骨分化;骨组织工程
【作者】司家文;郭礼和;沈国芳
【作者单位】上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科,上海市口腔医
学重点实验室上海200011;中美国联(上海)生物技术研究有限公司上海200333;
上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科,上海市口腔医学重点实验室
上海200011
【正文语种】中文
【中图分类】Q256
人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelium cell，hAEC）作为一类处于胚胎干细胞和成体干细胞过渡阶段的特殊干细胞样细胞，以其来源广泛，制备简单，产后胎盘组织不涉及伦理学问题，具免疫豁免能力，无致瘤性等优点，吸引了愈来愈多学者的研究兴趣，其在再生医学特别是骨组织工程方面具有的研究和应用价值，值得国内外同行共同探索研究。

1 羊膜和羊膜上皮细胞
灵长类动物的羊膜是一层光滑、无血管和神经的半透明薄膜，其内侧包绕胚胎，外与绒毛膜相延续，其厚度70~180 μm，具有较高的韧性。

作为胎盘的一部分，羊膜为胎儿提供可调节的符合局部运动的空间和适宜环境，通过滤过和物理缓冲作用，分泌营养因子，保持羊水中水和电解质平衡，抑制母体对胚胎的免疫反应等方式保护发生中的胚胎。

羊膜依次可分为上皮层、基膜层、致密层、成纤维细胞层和海绵层。

人羊膜上皮层靠近羊膜腔并直接与羊水接触，由单层立方或柱状细胞构成，这些细胞被称为hAEC，来源于受精后8~9 d的上胚层细胞；hAEC分泌糖蛋白、胶原和层黏连蛋白等物质形成其外侧的狭窄基膜层；基膜层的外侧是致密层，由致密的胶原纤维、网状纤维和无细胞基质组成，此层使羊膜可以耐受较高的牵张力；在致密层外侧是羊膜组织中最厚的成纤维细胞层，该层由人羊膜间质细胞（human amniotic mesenchymal cell，hAMC）和细胞外基质构成，由胚胎下胚层细胞迁徙分化形成；最外侧是海绵层，位于羊膜和绒毛膜之间，厚薄不一，组织疏松，羊膜与绒毛膜可自此处钝性分离[1-2]。

Pasquinelli等[3]在对比骨髓基质干细胞、hAEC和hAMC的超微结构后认为，骨
髓基质干细胞内宽大的粗面内质网和多房透明小泡，具有典型间质细胞特性，hAEC具有典型的上皮细胞样形态和超微结构，hAMC则表现出上皮-间质混合超
微结构特征，包括细胞表面微绒毛，与微绒毛平行的胞质内禢腔，细胞间连接，细胞质内粗面内质网、脂滴和发达的收缩微丝。

这些超微结构的区别提示，羊膜上皮细胞可能较骨髓基质干细胞有不同的功能及多向分化潜力。

2 羊膜上皮细胞的生物学特性
来自羊膜的细胞具有许多特殊的生物学特性，有关羊膜免疫调节作用的研究[4-5]
显示，将羊膜组织植入人体内后不引起或仅引起轻微的免疫反应，羊膜上皮细胞表面不表达主要组织相容性复合体2类抗原、组织相容性抗原（histocompatibility antigen，HLA）-DR及胸腺依赖淋巴细胞（简称T细胞或T淋巴细胞）共刺激分子B7-1、B7-2以及CD40、CD40L，仅少量表达主要组织相容性复合体1类抗原，如HLA-A、HLA-B和HLA-C，加入干扰素-γ诱导培养也不增加两者的表达；羊膜上皮细胞还可以分泌多种与损伤修复有关的细胞因子，如组织金属蛋白酶抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和血管内皮生长因子等，促进种
植细胞增殖，抑制炎症反应，抑制血管新生和瘢痕形成。

此外，羊膜上皮细胞还可以通过逃避T细胞识别，破坏自然杀伤细胞和T细胞的功能，以干扰树突细胞成
熟和分泌白细胞介素（interleukin，IL）-10、地诺前列酮（俗称前列腺素E2）、肝细胞生长因子等可溶性免疫调节因子的方式抑制淋巴细胞增殖，发挥免疫调节作用[6]。

hAEC分化于原始的二胚层胚盘，早于三胚层胚胎的形成，这一独特的组织胚胎学来源赋予了hAEC多向分化的潜能和独特的干细胞样特性。

来自于人羊膜的干细
胞具有较高的增殖分化潜力，可表达八聚体（octamer，Oct）4、关键蛋白（nanog）、氧化还原调节器（redox regulator，Rex）1和Y染色体性别决定
区相关高速泳动族蛋白盒（sex determination region of Y
chromosomerelated high mobility group-box，SOX）2等反映干细胞多能性的分子标志物，且通过流式细胞仪能够检测到体现胚胎干细胞全能性的表面标志物肿瘤排斥抗原（tumor rejection antigen，TRA）1～81，CD90，特殊阶段胚胎抗原（stage-specif i c embryonic antigen，SSEA）3、4，干细胞因子（stem cell factor，SCF）等[7-8]。

值得注意的是，Oct 4、关键蛋白和SOX2是一类关
键的胚胎干细胞相关转录因子，它们可以形成自我调节环路和多能性核心调控网络，抑制组织特异性基因，活化多能性信号转导通路，保持胚胎干细胞的全能性和自我更新能力；因此可以推测，羊膜上皮细胞可能较成体干细胞具有更高的多向分化潜力，其在体外及动物试验的大量研究也验证了其向三个胚层的高度分化能力[9-11]。

作为产前组织来源的细胞组织，产后hAEC和hAMC在体外培养条件下仍能以有
丝分裂的方式增殖，但却不能无限更新复制。

多数研究认为，这与这些细胞中缺乏端粒酶有关。

根据目前干细胞的定义标准，无限自我更新复制能力与三胚层分化能力是干细胞必须具有的细胞属性，因此从本质上来说，hAEC和hAMC应被称为
干细胞样细胞。

另一方面由于不合成端粒酶，hAEC植入体内并不形成畸胎瘤，在干细胞应用的安全性方面反较一般干细胞更具临床应用潜力。

3 羊膜上皮细胞和间质细胞骨向分化
自20世纪开始，羊膜组织就已经被应用于烧伤、溃疡治疗以及外科伤口愈合的临床处理。

羊膜上皮细胞向神经细胞、胰岛样细胞和心肌样细胞等多胚层分化的体内外研究[12]显示，羊膜上皮细胞具有骨向分化的潜力，在成骨诱导培养基中，可以表达成骨细胞特异性蛋白质和表面标志物，产生相应的形态学改变。

3.1 羊膜上皮细胞骨向分化
Ilancheran等[13]在以1,25-二羟胆骨化醇、维生素C和β-甘油磷酸诱导原代培
养的hAEC骨向分化的研究中发现，在试验4周时，细胞由鹅软石样形态向梭形、三角形转化，细胞质内碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）呈阳性，有骨
性矿物质沉积。

Zhou等[14]在研究了骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）7对hAEC的作用后发现，hAEC在含人重组BMP7或者转化生长因子β1的培养基中诱导3周之后，均可表达聚集蛋白聚糖（aggrecan）、SOX9、癌胚蛋白68和2型胶原等成软骨细胞特异性蛋白，将BMP7基因转入hAEC可以使细胞基质合成的能力明显增高。

Mattioli等[15]在对羊膜上皮细胞中Oct4、关键蛋白、SOX2的表达水平进行检测后发现：连续传代培养对细胞表面黏附分子、关键蛋白和SOX2存在影响，而DNA甲基化水平无明显改变，细胞内骨钙蛋白、AKP表达上调，细胞外基质矿化增加；将羊膜上皮细胞植入动物骨缺损后，可以观察到细胞快速广泛地成骨分化，且细胞可在移植部位存活45 d并持续形成新生骨。

朱雪敏等[16]也采用相似的方法成功地分离获得了具有干细胞特性的绵羊羊膜上皮细胞。

值得注意的是，人与动物羊膜上皮细胞间存在结构功能的差异，特别是hAEC端粒酶缺乏对其细胞增殖和体内存活具有何种影响尚有待进一步研究。

此外，由于胎盘中hAEC处于不同的分化阶段，具有明显异质性，如何在羊膜上皮细胞群中分离获得具有更高分化潜能的干细胞样细胞也具有较高的研究潜力。

3.2 羊膜间质细胞骨向分化
hAMC与hAEC相似，也具有低免疫源性和干细胞样特性，较成体间质干细胞具有更高的增殖分化潜力，体外骨向诱导后，hAMC内的AKP水平增加，核心结合因子α1 mRNA表达，细胞表达骨钙蛋白和1型胶原等成骨标志物，细胞外基质内可检测到矿化结节[17]。

有学者分别用接种有兔羊膜间质细胞的纳米左旋聚乳酸支架和无细胞空白支架修复兔颅骨全层缺损，于移植后8周对所有试验动物进行骨修复比较分析，结果显示所有试验动物缺损处均有新生骨形成，但接种细胞组局部骨组织密度及细胞外矿化水平明显高于无细胞组，且成骨效应更为稳定。

Chen 等[18]将hAMC接种于凝胶微球颗粒上，给予28 d两段式组装培养技术，制备出
直径2 cm、高1 cm具有良好活性和细胞分散度的柱状组织工程骨，结果显示在hAMC在骨诱导培养基中AKP水平持续增高，在21 d时细胞1型胶原及骨钙蛋白等成骨标志物表达，细胞外矿化组织质量持续增加。

由于hAMC缺乏端粒酶，其复制传代数极为有限，因此限制了对该细胞的大量制备及长期深入研究。

为了克服这一羁绊，有研究者[19-20]分别以反转录病毒转染系统将人端粒酶反转录酶基因转入hAMC，从而获得具有持续复制能力的永生化hAMC的试验方法。

试验结果显示，永生化的hAMC较亲代细胞形态、核型以及表面标志物和免疫源性无明显改变，细胞系倍增数可分别达到87和200倍；初步的体外诱导试验显示，这些细胞具有明显的成骨、成软骨和成脂分化能力，对于其在体内外的多向分化能力、安全性及其在组织工程中的应用潜力尚有待大量深入的研究。

4 小结
在将来的研究中，还需进一步探索hAEC和hAMC的分离、筛选、培养以及诱导的方法和机制，使其能更为有效地分化不同类型的组织细胞并应用于临床治疗实践中。

此外，采用基因工程改良的羊膜上皮细胞也有待深入研究。

综上所述，羊膜上皮细胞的基础和应用研究正在不断地发展突破，越来越多的学者相信，羊膜上皮细胞将成为重要的种子细胞来源，在再生医学领域中发挥积极的作用，为各种疾病的自身或异体组织细胞替代治疗提供新的选择。

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