检验科细菌耐药性监测标准操作程序SOP文件

检验科细菌耐药性监测SOP文件
一、耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococci,MRS）
MRS是引起临床感染的常见病原菌，同时也是引起医院感染的重要病原菌之一，其耐药特点是耐受甲氧西林的同时，还对临床广泛应用的多种抗生素呈现多重耐药，因而该菌所致感染已成为临床治疗的一大难题。

（一）MRS测定方法
1、纸片扩散法
接种物：直接悬液法
从非选择琼脂平皿上挑取少许单个菌落至无菌生理盐水调至浓度0.5 McFarland,具体操作同常规纸片法药敏试验。

苯唑西林纸片，1μg/片，检测MRS平板应置于35℃（而不是37℃）孵育24h（而不是16～18h）。

结果判断：
金黄色葡萄球菌：S：≥13mm；I：11～12mm；R:≤10mm。

凝固酶阴性葡萄球菌：S：≥18mm；R≤17mm。

对于苯唑西林纸片周围的抑菌圈内有任何小菌落或稀薄“菌膜”生长都应列为MRS。

2、琼脂筛选法：如果纸片试验结果中介时，可做琼脂筛选法，培养基为MH琼脂+6μg/ml苯唑西林+4%NaCl，调整菌液浓度0.5McFarland，于35℃孵育24h，凡有任何生长即使一个菌落均报MRS。

（二）MRS监测意义
对于MRS，应报告对所有头孢菌素类和其他β-内酰胺酶类耐药，喹喏酮类药物，除氟哌酸外，环丙氟哌酸，氟嗪酸有较好抗菌活性（耐药率10～23%之间），利福平敏感率在90%以上，未见耐万古霉素菌株，但已有万古霉素中介金黄色葡萄球菌。

二、高水平耐药的肠球菌（HLAR）及耐万古霉素的肠球菌（VRE）
（一）药敏测定方法
1、常规测定方法：采用K-B纸片扩散法，头孢菌素不用做（均为耐药），氨苄，庆大霉素，替考拉宁，
万古霉素一定要做。

2、高水平氨基糖甙类耐药性测定：
⑴高含量纸片扩散法：
通常测定庆大霉素和链霉素的高度耐药性，具体操作如常规纸片法药敏试验。

药敏纸片：庆大霉素：120μg/片；链霉素300μg/片
结果判断：R：≤6mm；I：7～9mm；S：≥10mm
⑵含单一高浓度抗生素琼脂平皿法：
稀释法：庆大霉素：R：≥500μg/ml；链霉素：R：2000μg/ml
3、万古霉素耐药性测定：
纸片扩散法，具体操作如常规纸片法药敏试验，万古霉素纸片为：30μg/片，检测平皿置35℃24h（而不是16～18h），并注意抑菌圈内有无小菌落或薄膜生长。

判断标准：
S：≥17mm；I：15～16mm；R：≤14mm
结果为中介时，应补作MIC法。

（二）高浓度药敏测定意义
肠球菌是引起临床感染的常见病原菌之一，有天然抵抗多种抗生素的特性，临床常用协同用药治疗肠球菌感染，但是当肠球菌获得了氨基糖甙类活性酶后，会发展成高度对氨基糖甙类耐药性，而失去协同作用。

通常肠球菌对氨基糖甙类高水平耐药测定可用庆大霉素或链霉素测定，如无高水平耐药，预示可与青霉素氨苄西林协同用药，若高度耐药，预示协同用药无效。

耐万古霉素肠球菌，尚无规定的方案，可选氨苄西林联合庆大霉素，联合利福平等。

三、耐万古霉素金黄色葡萄球菌的监测
尽管目前国内还未发现耐万古霉素的金葡菌（但已有中介的）但必须严密监视其耐药性，一旦发现并确认应报告。

（方法同常规法）
四、耐青霉素的肺炎链球菌（PRP）的监测
1、方法：用1μg/片苯唑西林纸片代替青霉素纸片测定PRP。

2、判断：抑菌环≥20mm为敏感。

抑菌环≤19mm时要用稀释法测定，不能报告。

只有稀释法确定后方可报告。

3、注意点：用稀释法测定PRP时应选P、CTX、CRO、Va这些药物来做。

五、β-内酰胺酶测定
采用双纸片协同法或头孢硝基噻吩（Nitrocefin)纸片法，即用无菌蒸馏水将Nitrocefin纸片浸湿，挑取待检菌涂抹在Nitrocefin纸片上，10min内变红者为阳性。

或采用AS-4仪器检测（需青霉素和碘试剂）。

其意义主要是针对葡萄球菌，嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等，一般阴性杆菌不做此检测。

六、超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）测定
ESBLs是一类水解底物相当广泛的β－内酰胺酶，不仅能水解青霉素和一、二代头孢菌素，还能水解三代头孢菌素（如头孢他啶，头孢噻肟等）及单环β－内酰胺类，给临床治疗带来相当大的困难。

ESBLs的基本概念是：①主要由克雷伯菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生，②在体外试验中，可使三代头孢菌素和氨曲南的抑菌圈缩小，但并不一定在耐药范围，③加入克拉维酸可使其抑菌环扩大，④临床上对β－内酰胺类药物（包括青霉素和头孢菌素）耐药，但对碳青霉烯类和头霉烯类药物敏感，⑤由质粒介导往往由普通的β－内酰胺酶基因（TEM-1，TEM-2，SHV-1）突变而来。

（一）ESBLs测定
⒈纸片扩散初筛法：按美国NCCLS标准实施。

具体操作如常规纸片法药敏试验，符合如下标准之一为产ESBLs的细菌。

头孢泊肟10μg/片≤22mm
头孢他啶30μg/片≤22mm
氨曲南30μg/ 片≤27mm
头孢噻肟30μg/片≤27mm
头孢曲松30μg/片≤25mm
⒉双纸片增效扩散法：用头孢他啶（30μg）头孢他啶／棒酸(30μg/10μg)头孢噻肟（30μg）头孢噻肟／棒酸（30mg/10μg）纸片按扩散法进行，以任一抗生素复合物与单独药的抑菌圈直径之差≥5mm为产ESBLs菌。

⒊双纸片协同扩散法：药敏平板与菌液的制备方法与常规药敏相同，先在平板中心贴上阿莫西林／棒酸纸片，而后在其上下左右贴30μg/片的头孢他啶，头孢噻肟，头孢曲松和氨曲南纸片，各纸片相距20～30mm （中心－中心），35 ℃18～24h观察结果如周围4个药敏纸片中的任何一个显示协同即为产ESBLs菌。

（二）ESBLs 测定意义
临床分离的大肠埃希菌和克雷伯菌（主要是肺克和产酸两种），均应检测是否产生ESBLs,如确认为ESBLs 菌株,不管体外药敏试验的结果如何,对所有三代头孢菌素和氨曲南均应报告耐药。

针对ESBLs的特性和耐药特点，临床治疗推荐使用：①碳青霉烯类：泰能等。

②复合三代头孢菌素：舒普深等加大剂量。

还有头霉素类，环丙沙星，氨基糖甙类联合使用。

七、AmpC β-内酰胺酶（持续型）测定
AmpC β-内酰胺酶是头孢菌素酶，为Bush分类C组I型酶，通常称为I型AmpC酶。

产该酶菌株对β-内酰胺类抗菌素广泛耐药（含窄谱、广谱、超广谱和含酶抑制剂的抗菌素及氨曲南）。

（一）、单纸片扩散法（初筛试验）将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在平板上贴上CAZ、CTX、CRO、AZT、CPI（头孢泊肟）、CFT（头孢西丁），置35℃过夜培养，若抑菌环直径CAZ≤14mm、CTX≤14mm、CRO≤13mm、AZT≤15mm、CPI≤14mm、CFT≤14mm时为可疑产AmpC酶菌株。

或采用：IP（亚胺培南）、FEP（头孢吡肟）、CD02( 他啶+棒酸）、CTX、FOX（头孢西丁）纸片贴于待测菌平板上，35℃过夜培养。

AmpC酶可疑菌株应为：FEP、IP为敏感，而CTX、CD02、CD03均耐药或者在CD02、CD03和CTX的抑菌环内存在散在菌落。

或者是IP为敏感，FEP、CTX、CD02、CD03均为耐药。

（二）双纸片协同法（初筛试验）将含有200μg/片氯唑西林纸片（FCC）贴于MH平板中央，周围分别贴上CAZ、CTX、CRO、AZT、CPI、CFP（头孢哌酮）纸片，纸片中心距离为20mm，置35℃过夜培养，观察有无协同现象，FCC与任何一种ESC有协同现象者为AmpC酶阳性菌株。

（三）双纸片增效法：即加有氯唑西林的复合纸片减去单药纸片的差≥5mm时为阳性。

六组纸片中，只要有一组≥5mm即可，六组纸片参见（二）双纸片协同法。

（四）三维沟槽法：操作比较复杂，实验室难以常规应用，但到目前为止是测定AmpC酶比较可靠的方法。

（五）产AmpC酶菌株有：阴沟、产气、弗劳地、粘质、铜绿、普通与奇异变形、摩根、大肠、肺克等，尤其是阴沟一定要报告给临床。

八、Metello β-内酰胺酶测定
采用双纸片协同法（抑制法）
意义：用于金属β-内酰胺酶的检测。