超声破碎重组大肠杆菌释放包含体的过程研究

收稿日期:2002-03-24
基金项目:国家95重点攻关项目(96-C02-01-04)作者简介:吴　蕾(1968-),女,辽宁人,天津大学化工学院讲师,在职博士,主要从事基因工程药物研究。

研究论文
超声破碎重组大肠杆菌释放包含体
的过程研究
吴　蕾1
,雷　鸣2
,洪建辉,甘一如
1
(11天津大学化工学院,天津300072;21天津大学环境科学与工程学院,天津300072)
摘要:重组人白细胞介素(rhI L -6)基因表达产物在大肠杆菌的细胞浆中以包含体的
形式存在。

用超声破碎法提取rhI L -6包含体系统研究了该过程中的物理和化学因素,包括破碎时间,输出功率,菌体浓度,缓冲液pH 值,菌体冻融及悬浮液体系等。

得到了破碎提取包含体的最适条件为:超声功率480W ,菌体浓度为100g ΠL 左右。

在去离子水中经过15min 超声破碎,表达量为20%的菌体可获得包含体的含量为40%(,下同)。

关键词:超声破碎;重组大肠杆菌;重组人白细胞介素-6;包含体中图分类号:Q81　文献标识码:A 文章编号:1004-9533(2002)06-0422-04
Studies of U ltrasonic Disruption Process to R elease
I nclusion Body in R ecombinant E .Coli
W U Lei 1
,LEI Ming 2
,H ONGJian -hui ,G AN Y i -ru
1
(1.School of Chem ical Engineering ,T ianjin University ,T ianjin 300072,China ;
2.School of Environmental Science and Engineering ,T ianjin University ,T ianjin 300072,China )
Abstract :The product of recombinant human interleukin -6was expressed and existed in the form of intracellular protein inclusion body in the cytoplasm of recombinant E .Coli cell.A systematic study was carried out on the in fluence of physical and chemical factors including power output ,disrupting time ,cell concentraction ,buffer pH ,cell frozen and suspension system during ultras onic process.The conditions of disruption and release of inclusion body was deter 2mined :by ultras onic ouput power 480W ,cell concentration 100g ΠL ,in the deionized water sus 2pension system ,obtained 40%original inclusion body from the biomass with 20%expression level.
2002年12月Dec.2002 化　学　工　业　与　工　程CHE MIC A L I NDUSTRY AND E NGI NEERI NG 第19卷　第6期
V ol.19 N o.6
K ey w ords:ultras onic disuption;recombinant E.Coli;rhI L-6;inclusion body
近年来,随着重组DNA技术的发展,胞内基因工程产物的数量不断增多,如人生长激素,白细胞介素及干扰素等。

对于这些在大肠杆菌(E.Coli)中表达的真核基因产物往往都以包含体的形式存在于E.Coli胞浆中[1],故将细胞破碎提取包含体的纯度关系到目标蛋白提取的纯度和收率。

目前超声破碎法主要用于实验室规模的细胞破碎,国外对超声破碎细胞的研究主要集中在酵母细胞的破碎释放可溶性蛋白[2、3]。

但对用超声破碎重组大肠杆菌细胞释放包含体过程的各种影响因素迄今尚水见文献报道。

本文用重组大肠杆菌为材料,以释放出的白细胞介素-6包含体纯度为指标,重点考察了输出功率,缓冲液pH值,菌体冻融,悬浮液体系等对蛋白质包含体释放的影响。

1　材料与方法
111　菌种及质粒
所用菌种为大肠杆菌菌株pop2136,表达白细胞介素-6的重组质粒为p K pL3A。

112　菌体培养与收集
rhI L-6表达质粒的转化菌株于30℃培养。

先摇床培养10h,转入10L发酵罐上发酵。

培养基组成为:蛋白胨48gΠL,酵母抽提粉30gΠL,NaCl15gΠL,Na
2
HPO4・12H2O512gΠL, K H2PO49gΠL。

在30℃培养至对数生长期后,迅速转至40℃诱导rhI L-6基因表达,约4h 后停止发酵,离心发酵液收集菌体。

113　细胞超声破碎方法
将发酵收集的菌体定量悬浮于100m L 的烧杯中,置于冰水混合液中,打开电源,设置超声强度及超声时间,启动超声波发生器,定期取样分析。

所用的超声辐射系统为超声破碎仪Ultras onic H om ogenizer-4710。

114　rhI L-6含量的测定法
用S DS-PAGE电泳法[4]测定rhI L-6的含量。

2　结果与讨论
211　超声功率对释放rhI L-6包含体的影响在不同的输出功率下,对菌体进行超声破碎,rhI L-6含量与时间的关系如图1。

由图可见,随破碎时间的增加,rhI L-6的含量均有提高,在10min后基本趋于稳定。

输出功率为480W
时rhI L-6的含量比输出功率为360W时其含量高出10个百分点。

当输出功率为600W时,在前5min,rhI L-6的含量比480W时的含量略高,5min后,rhI L-6的含量下降,且低于480W时的含量,而240W与360W对细胞破碎的影响相差不大。

□———600W;■———480W;
▲———360W;●———240W
图1　输出功率对超声释放包含体的影响
超声波对细胞破碎的作用机理主要与超声的空化效应有关。

溶于菌悬液中的空气构成空化核,当超声强度超过一定阈值时,空化核被激活,进行非线性震荡或经历膨胀被压
324
第19卷第6期吴　蕾等:超声破碎重组大肠杆菌释放包含体的过程研究
缩直至崩溃的过程。

空化效应伴随产生的冲击波声流等,可破坏细胞壁的网状结构,从而使包含体释放出来。

细胞破碎需克服的主要阻力是细胞壁网状结构的共价键。

输出功率增大,超声强度随之增大,使细胞壁裂成更小的细胞碎片。

通过离心可使细胞碎片与粗包含体分离,提高包含体纯度。

但若输出功率过大,则空化效应可能破坏包含体中的蛋白质分子,产生小分子物质,不利于包含体的纯化。

总体看来,输出功率过小,
菌体不能破碎,包含体不能被释放出来;而超声强度过大会破坏部分包含体,不利于纯化。

经多次试验,最后选择的菌体破碎条件是:输出功率480W ,超声时间15min 。

212　缓冲液pH 值对释放包含体的影响不同的pH 值下,时间与rhI L -6含量的关系如图2所示。

由图可见,在pH 值为rhI L
□———pH =10.0;■———pH =8.0;▲———pH =6.0;●———pH =4.0图2　缓冲液pH 值对超声释放包含体的影响
-6等电点的缓冲液中,rhI L -6的含量最
小。

而在pH 值高于或低于rhI L -6等电点
的缓冲液中,rhI L -6的含量要高些。

这是因为碱性溶液或酸性溶液对组成大肠杆菌细胞壁的肽聚糖蛋白质层及脂多糖层有水解作用,从而削弱了细胞壁的机械强度,使细胞易
于破碎,释放包含体。

同时,酸碱溶液还能溶解细胞壁和细胞膜上的部分蛋白,有利于减少沉淀中粗包含体杂蛋白的含量,从而提高包含体的纯度。

但缓冲液的酸度或碱度过高,有可能溶解包含体,使包含体受损。

213　不同悬浮液体系对释放包含体的影响
分别将菌体悬于去离子水,TE 缓冲液(50mm ol ΠL T ris -HCl ,1mm ol ΠL E DT A ,0.3m ol ΠL NaCl ,pH 8.0)和P BS (0101m ol ΠL ,pH 8.0)
中,进行超声破碎。

图3示出了上述3种悬浮体系中,破碎时间与rhI L -6含量的关系。

由图可见,3种体系中,rhI L -6的含量均随破碎时间的增加而增大。

P BS 体系中rhI L -6的含量比TE 体系中的rhI L -6的含量略高,而去离子水中的rhI L -6的含量高出P BS 体系中rhI L -6的含量近十个百分点。

这说明不同悬浮液体系对超声破碎的效果有不同影响。

在去离子水中,重组大肠杆菌细胞更容易破碎,其主要原因可能是由于渗透压的突然变化,引起悬浮于去离子水中的大肠杆菌细胞的胞壁破裂。

□———TE;■———P BS;▲———Water 图3　悬浮体系对超声释放包含体的影响
文献报道的重组大肠杆菌细胞破碎均用
TE 或P BS 悬浮[5]
,用去离子水悬浮重组大肠杆菌细胞,国内外文献还未见报道。

本文的
424 化　学　工　业　与　工　程2002年12月
试验结果表明,用去离子水悬浮重组的大肠
杆菌细胞提取rhI L -6包含体,破碎效果明显好于TE 和P BS 缓冲体系。

214　冻融对超声释放包含体的影响
冻结-融化是将细胞放在低温下突然冷冻后在30℃下融化的过程。

图4示出了在冻融和未冻融条件下,超声时间与rhI L -6含量的关系曲线。

可见冻融后rhI L -6含量高于未冻融时rhI L -6含量的5个百分点。

说明细胞经冻融后,
更易超声破碎而释放包含体。

这是因为:冷冻,一方面能使细胞膜的疏水键断裂,增加了细胞的亲水性;另一方面胞内的水结晶,使胞内外溶液浓度变化引起细胞突然膨胀而破裂。

同时在超声波的作用下,细胞壁裂解,胞内包含体比较容易地被释放出来。

□———冻融;■———未冻融图4　冻融对超声释放包含体的影响
215　发酵过程对释放包含体的影响
在发酵培养过程中,培养基的组成,操作参数(如pH 值,温度,通气量及稀释率等)与
细胞生长期等因素对细胞破碎都有影响[6]。

从溶氧来看,溶氧直接影响菌体的新陈代谢,生长和目标蛋白的表达。

试验表明,低溶氧下,目标蛋白的表达量为20%,高溶氧下其表达量为12%,高溶氧有利于目标蛋白表达量的提高。

而目标蛋白表达量较高时,超声
硫碎后所获得的粗包含体纯度也较高。

Middelberg [7]
等人研究表明重组大肠杆菌细胞内外源蛋白充分表达比没有诱导的大肠杆菌细胞容易破碎。

这是因为外源蛋白表达时,细胞代谢能量很大一部分直接转向外源蛋白的表达,而没有用于细胞的生长和代谢,因而消弱了细胞壁强度,使细胞容易被破碎。

3　结论
超声破碎提取包含体的影响主要因素有:超声破碎时间,菌体浓度,超声仪的输出功率,悬浮菌体的缓冲液的pH 值,悬浮体系,冻融及发酵过程等。

本文确定的超声破碎提取白细胞介素-6包含体的工艺条件为:冰浴,输出功率480W ,菌体浓度为100g ΠL ,悬浮体系为去离子水,超声破碎时间15min ,表达量20%的菌体可获得粗包含体的纯度为40%左右。

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5
24第19卷第6期吴　蕾等:超声破碎重组大肠杆菌释放包含体的过程研究 。