聚乙二醇诱导鸡红细胞融合实验方案的优化

人工介导或培养条件下，使两个或两个以上的离体细胞合并成为一个双核或多核细胞的过程[1,2]称之为细胞融合技术，该技术作为细胞工程的核心技术，在农、牧、医、药、食品等领域具有广泛的应用价
聚乙二醇诱导鸡红细胞融合实验方案的优化
李玲刘欢贺亚玲崔林唐慧张君张亮
（石河子大学医学院，新疆石河子，832002）
【摘要】目的：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合法是最为经济、简单的细胞融合技术，但受多种因素影响，实际实验效果并不理想，为获得高效稳定的细胞融合效率，本研究拟对PEG诱导的鸡红细胞的融合实验进行优化。

方法：调整鸡红细胞的采集与保存方式、细胞浓度、缓冲系统（GKN与1640）、pH、诱导与孵育时间，以及染液的选择等。

结果：弱碱PEG环境（pH≈7.8）下诱导与孵育时间均采用5min时，细胞融合率最高（17.87%），显著高于未调节pH组及诱导与孵育时间20min组（＜0.01）；pH>8时，细胞聚集但胞膜皱缩破裂，计算融合率困难；亚甲基蓝、中性红染色时间>20min时，细胞膜亦皱缩破裂。

结论：宜选择肝素类抗凝管采集及保存鸡血，在GKN或1640缓冲系统中，以全血与试剂1:9比例洗涤及孵育，弱碱PEG环境（pH≈7.8）分别诱导、孵育5min，并在20min内观察亚甲基蓝或中性红染色结果，该方案适宜应用于PEG诱导的鸡红细胞融合实验教学。

【关键词】聚乙二醇；细胞融合；鸡红细胞；缓冲体系；pH；时间；染色剂
中图分类号：G642.423；R394-33文献标识码：A
Optimization of the Experimental Scheme for Chicken Red Blood Cell Fusion
Induced by PEG
LI Ling，LIU Huan，HE Ya-ling，CUI Lin，TANG Hui，ZHANG Jun，ZHANG Liang
（Shihezi University Medical College，Shihezi，Xinjiang832002）
【Abstract】Objective：PEG-mediated cell fusion is the most economical and simple cell fusion technique.
However the experimental results are not ideal due to various factors.In order to obtain efficient and stable cell fusion efficiency，we optimized the experiment.Methods：Methods of the chicken red blood cell collection and preservation，cell concentration，buffer system(GKN and1640)，pH，induction time and incubation time were adjusted，as well as other methods such as selected different dyes.Results:In the weak alkali environment(PEG pH≈7.8)，the cell fusion rate was the highest(17.87%)when both the induction and incubation time were5min，which was significantly higher than that of the group without adjusted pH and the group with induction and incubation time of 20min(＜0.01).At pH>8，cells gathered trend obvious，but it was difficult to calculate the fusion rate due to the cell membrane shrinkage and rupture.The cell membranes were also crumpled when the staining time was more than 20min with methylene blue or neutral red dye.Conclusion：It is recommended to collect and store chicken blood with heparin anticoagulant tubes，whole blood was washed and incubated with GKN or1640buffer at a ratio of1:9 and then weakly basic PEG was used to induce and incubate the cells for5min respectively，and the cell staining results within20min were observed with methylene blue or neutral red dye，this scheme is suitable for practical experiment teaching.
【Key words】Polyethylene glycol(peg)；Cell fusion；Chicken red blood cell；Cell Buffer system；pH；Time；Dye solution
基金项目：石河子大学教育教学改革项目（SJ-2018-15）；国家自然基金项目（81600325）。

通讯作者：张亮，副教授，硕士研究生导师，从事医学生理学研究。

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值。

体外诱导细胞融合的方法主要分物理法、化学法、生物法。

其中化学法是利用化学试剂如聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜（DMSO）、脂质体等改变细胞膜脂质分子排列诱导细胞融合。

PEG介导的细胞融合法因其操作简便、无需复杂的仪器，融合效果好等[3]优点成为最常用的体外诱导融合方法，也是医学本科生细胞生物学实验课中的首选方法。

然而，在实际实验教学中，细胞融合效果并不理想。

查阅资料发现：温度、细胞物种来源、细胞保存液、诱导缓冲系统、PEG的质量分数、诱导与孵育时间、pH、细胞浓度及新鲜程度等均可能影响细胞融合的效率。

目前，鲜有区分细胞融合与重叠的文献介绍，甚至有研究选择无核红细胞为融合材料，更是难以区分细胞是否真正发生了融合，造成融合率虚高或误判。

为明确获得稳定高效的细胞融合效率，笔者通过调整鸡红细胞保存液、细胞浓度、缓冲系统、pH、诱导与孵育时间，以及染液的选择等对鸡红细胞的融合实验进行了优化，取得较好的实验效果。

1材料与方法
1.1动物
一龄公鸡，市购。

1.2试剂与耗材
RPMI1640培养液（北京索莱宝科技有限公司）；亚甲基蓝、中性红（天津市天新精细化工公司）；PEG4000、NaCl、KCl、Na2HPO4·2H2O、NaH2PO4·H2O（天津市盛奥化学试剂公司）；生理盐水（实验室自制0.85%NaCl溶液）；采血针（江西长青医疗科技有限公司）；肝素钠抗凝采血管（江苏康捷医疗器械有限公司）等。

1.3仪器设备
20-200μL与1000μL量程的微量移液器（Ep-pendorf，德国）、离心机（Eppendorf，德国）、水浴锅（上海一恒）、显微镜（OLYMPUS，日本）。

1.4实验方法
1.4.1试剂配制
（1）GKN溶液配制参照李英芳[4]方法；（2）0.1%中性红染液：用GKN或1640对1%的中性红水溶液10倍稀释，1500rpm离心1min，取上清液为染色液；（3）0.2%亚甲基蓝染液：用GKN或1640对2%的亚甲基蓝水溶液10倍稀释，1500rpm离心1min，取上清液为染色液；（4）不同pH的PEG：于刻
度离心管内加入PEG（MW=4000），隔水加热溶解，待冷却至50℃时，分2份后分别等体积加入50℃预热的GKN溶液与1640细胞培养液，配制为50%的PEG溶液，将GKN稀释与1640稀释的PEG溶液分别分为3份，用稀HCl与NaOH溶液调节pH，配制为PEG-A（GKN稀释pH≈6.8）、PEG-B（GKN 稀释pH≈7.8）、PEG-C（GKN稀释pH≥8）、PEG-D （1640稀释pH≈6.8）、PEG-E（1640稀释pH≈7.8）、PEG-F（1640稀释pH≥8）溶液，39℃水浴备用。

1.4.2采集、洗涤红细胞
鸡翼下静脉用75%乙醇消毒后，以静脉采血针采血2～4mL于肝素钠抗凝采血管中，轻微来回颠倒数次使血液充分与肝素接触。

分别向6组1.5 mL空EP管中加入100μL抗凝全血与900μL生理盐水，混匀，1500rpm离心1min，弃上清；再向管底沉淀中加入900μL生理盐水混匀，1500rpm离心1min，弃上清，重复此步骤，共洗涤鸡红细胞3次。

1.4.3孵育
向其中3组EP管底沉淀中分别加入900μL GKN溶液，另外3组加入900μL1640培养液，混匀，1500rpm离心1min以洗涤去生理盐水，弃上清。

再次向管底沉淀中分别加入对应的900μL GKN溶液与1640培养液，混匀，于39℃孵育5min。

1.4.4融合诱导
1500rpm离心1min，尽可能弃去上清，勿残留液体，避免影响PEG溶液工作浓度；轻弹EP管底部，使沉淀细胞疏松，分别向各组EP管中加入200μL 的PEG-A、PEG-B、PEG-C、PEG-D、PEG-E、PEG-F，边向管中加入边吹打混匀，在整个操作过程中保持鸡红细胞始终浸没于39℃水浴中。

1.4.5融合孵育与终止融合
从各组EP管中吸取50μLP EG诱导的鸡红细胞分别加入新的EP管中，继续孵育5min，各组剩余部分孵育20min。

向各组EP管中加入相应的GKN 溶液或1640细胞培养液补齐体积至1mL，孵育5min组于39℃再孵育5min终止融合，孵育20min 组再孵育20min终止融合；1500rpm离心1min，弃上清。

1.4.6重悬细胞、染色
向各组管底沉淀中分别加入200μL相应的GKN溶液或1640细胞培养液重悬细胞，吸取少量各组细胞悬液于载玻片上，分别滴加0.2%的亚甲
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基蓝和0.1%的中性红染液（细胞悬液与染液比例为4:1），加盖玻片后于显微镜下观察。

1.4.7计算细胞融合率
随机选取镜下视野，以该视野内已发生融合的细胞核数与该视野内的总细胞核数的百分比为细胞融合率，即：细胞融合率=已融合细胞核数/总细胞核数*100%。

1.5统计学处理
每组实验设3个重复，其中某一因素固定条件下，另外两种因素各组实验数据间采用双因素方差分析，以＜0.05为差异显著，＜0.01为差异极显著。

2结果
2.1细胞采集、保存及细胞密度
肝素钠抗凝采血管采集鸡血细胞于4℃保存，
稳定性良好，1w 内细胞膜完整，细胞核清晰，形态规则，无明显变化，如图1所示。

鸡红细胞与生理盐水1:9体积混合洗涤，再与相应的诱导缓冲体系1:9混合时，浓度介于106~107之间。

图1肝素钠抗凝鸡全血涂片（400×）
注：A ：4℃保存1d ，B ：4℃保存7d 。

2.2细胞融合判断
适当诱导条件下，相邻鸡红细胞互相融合成双核或多核细胞，如图2A 、B 所示；注意区分重叠细胞与融合细胞，可在稍暗视野下微调显微镜细准螺旋，重叠细胞间会有重叠细胞膜印记出现或消失，
已融合细胞不因调节发生此现象，如图2C 、D 所示。

当诱导融合剂pH>8时，鸡红细胞膜多发生破裂，形态不规则，无法区分细胞重叠与细胞融合，如图3A 、B 所示；滴加染液后，随着镜下观察时间的延长，红细胞膜逐渐皱缩，如图3C 、D 所示。

图2融合与重叠鸡红细胞（400×）
注：A 、B 示融合鸡红细胞，C 、D 示重叠鸡红细胞。

图3不适环境鸡红细胞破裂图片（400×）
注：A 、B 示pH ＞8环境，C 、D 分别表亚甲基蓝与中性红染色时间＞20min 。

2.3时间因素对融合率的影响
GKN 与1640缓冲体系显示了相似的结果，均是融合孵育5min+终止孵育5min 组融合率高于融合孵育20min+终止孵育20min 组，其中PEG 的pH ≈7.8时，融合孵育5min+终止孵育5min 组融合率极显著高于融合孵育20min+终止孵育20min 组（＜0.01），如图4A 、B 所示。

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图4PEG介导的鸡红细胞融合率
2.4pH因素对融合率的影响
当诱导融合与孵育时间因素相同时，GKN与1640缓冲体系组间显示了相似的结果，PEG的pH≈7.8时，细胞融合率极显著高于pH≈6.8组，（<0.01）如图4A、C所示，其中诱导融合与终止孵育均为5min时，GKN缓冲体系组与1640缓冲体系组细胞融合率分别为17.82%与17.87%。

2.5缓冲体系因素对融合率的影响
诱导与孵育时间、PEG的pH均相同时，GKN 与1640缓冲体系组间融合率无显著差异，如图4B、C所示。

3讨论
形态完整、规则，状态良好的细胞是诱导鸡红细胞成功融合的关键因素之一。

不同抗凝剂对红细胞渗透脆性影响较大，为避免这种影响，应使用肝素类抗凝剂[5]。

传统的Alsver液4℃保存鸡红细胞不能超过24h，究其原因是该保存液以柠檬酸钠作为主要抗凝成分，对细胞渗透脆性产生了一定影响。

本研究采用肝素钠抗凝采血管采集鸡血，4℃保存1w内细胞状态无明显变化，在林振忠等[6]报道中抗凝血可以在4℃保存16d，因此本研究中肝素抗凝血质量足以保障一周内学生实验的要求。

该方法优于传统的注射器采血方法，静脉采血针受进针角度限制小，且用血量较大时，只需更换抗凝管，无需更换注射器，避免触动针头使其滑出；采血前无需准备灭菌试管、单独配制保存液，操作更加方便，更重要的是该方法可以保证鸡血不受污染，这也是能长效保持细胞形态的一个原因。

PEG作为最常用的体外诱导融合剂，主要原理是在热力学力与渗透压作用下，细胞膜之间紧密接触后，借氢键与水分子结合，导致细胞脱水，相接触的细胞膜磷脂双分子疏散、重排，膜脂双层相互间的亲合力及细胞膜表面张力引起相邻的重排质膜在修复时合并，发生融合[7]。

PEG诱导的细胞融合受细胞密度，PEG相对分子质量[1]、浓度、融合时间、温度、pH等多种因素的影响。

本研究中选择学者们[2,8,9]普遍认可的50%的PEG（MW=4000）为诱导融合剂。

另，不同种属来源的细胞最适融合温度不同[10]，为使细胞所处环境尽可能接近体内环境，本研究选择与禽类体温（39℃）相同温度为孵育温度。

适宜的细胞密度是细胞融合的另一重要因素。

细胞密度大，虽有利于细胞间互相靠近，但细胞重叠挤压影响正确识别细胞融合，细胞密度过小则不
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利于细胞间互相接近。

文献中多以106个/mL[11]或107个/mL[1]为细胞融合最适密度，大多资料[2,12]以1:4比例洗涤及诱导孵育红细胞，实际操作中均需要借助计数器计数再次稀释调整细胞比例，使其达到最适细胞密度。

经多次实验，本研究最终以1:9比例选择生理盐水及诱导孵育试剂用量，可使细胞密度介于106~107之间，保证实验质量的同时，避免了用细胞计数板计数和稀释的过程，节省了实验时间。

研究中，弱碱环境PEG极显著增加了细胞融合率，这与张丽娇[13等研究结果类似。

未调节pH组融合效率较低，当pH略大于8时，细胞虽有靠近聚集趋势，但包膜皱缩破裂，难以定性重叠或融合。

其原因一可能是pH对PEG活性产生了影响，原因二可能是pH对融合细胞自身产生了影响[14]。

偏酸环境PEG活性较低；偏碱环境PEG可能促进了细胞聚集接触、引起磷脂双分子层疏松重排，但细胞膜过于疏松导致破裂不完整，没有足够的表面张力完成修复；只有对PEG活性和红细胞都适宜的pH才能既使细胞膜贴近疏松、重排，也能够完成之后的修复过程。

加入PEG之后的融合孵育时间文献中各不相同，介于5min~40min不等[2,10,13,15,16]，终止融合时间也是介于5min~20min不等[2,11,13]；但该实验用于教学时，应尽可能缩短各步骤用时。

对比各研究中的细胞融合率，本研究中最佳融合率17.87%与马云[16]孵育5min时17.73%、张丽娇[13]研究中pH=7时17.72%的融合率最为接近。

未调节pH组融合率6.9%与王惠[9]报道中5.4%接近。

一些文献中采用兔[9]、牛[15]、人[4]的无核红细胞作为融合细胞，融合率相对较高，有学者认为这是由于不同细胞膜分子有差别[17]。

虽然以无核细胞为材料仍可以调节显微镜细螺旋，重叠的细胞之间会有接触的印记出现，融合细胞无此现象为区分融合或重叠的依据，但若没有细胞核作为参照，很难区分某些体积较大的细胞是由几个细胞融合而来。

如图2A、C中，因为有细胞核作为参照，可以明确是两个细胞发生了融合，而不会因为其中一个细胞较大认为是来自三个或更多个细胞的融合，故仍建议选用鸡、牛蛙[12]、蟾蜍[1]等动物的有核红细胞作为研究材料。

亚甲基蓝与中性红染液均可用于活体细胞的染色，但随着染色时间的延长，染色细胞的胞膜均逐渐皱缩、甚至破裂，以致不能区分细胞重叠或融合。

在刘建勇[18]、殷华[19]等学者的研究中，亚甲基蓝对糠虾幼体、南美白虾幼体、水丝蚓产生毒性的浓度分别为0.029mg/L、0.025mg/L、2.64mg/L，而作为染色用途时，甲基甲蓝的浓度达到了2g/L，或许是这种高浓度引起的渗透压变化，也可能是细胞毒性作用，最终导致细胞膜皱缩破裂，未见中性红使用剂量与细胞毒性之间关系的报道，分析其原因应与亚甲基蓝类似。

在具体使用过程中，建议观察滴加染液20min以内的结果。

4结语
PEG诱导的细胞融合受多种因素影响，应用于实验教学时，应选择适宜观察的有核红细胞、粘度适宜便于操作的50%浓度PEG为实验材料；利用肝素类抗凝管采集血液方便，且4℃保存细胞稳定性好；全血与洗涤液、缓冲试剂1:9比例时细胞密度适宜融合；pH宜调节至7.7~8.0之间；孵育与终止时间建议各5min。

为取得较好的实验效果，加入PEG 之前应尽可能确保没有残留液体，且轻弹EP管底部使细胞疏松，能充分与PEG接触而不凝集呈团。

随着对PEG诱导细胞融合原理的进一步揭示及实验技术的不断发展，或可实践出更加稳定、融合效率更高的优化方法。

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[收稿日期：2020-02-15]
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