高效液相色谱荧光检测法测定牛奶中4种氟喹诺酮类药物残留

高效液相色谱荧光检测法测定牛奶中4种氟喹诺酮类药物残
留
廖洁丹;李智丽;张济培;陈建红;杨鸿
【摘要】为了建立一种同时测定牛奶中4种氟喹诺酮类药物(恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星)多残留高效液相色谱检测方法,将牛奶中的残留药物用磷酸-
甲醇溶液重复提取2次,正己烷除去脂肪净化后浓缩,流动相溶解后用高效液相色谱-荧光检测器测定.结果表明,4种氟喹诺酮类药物在0.01～1.00 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系(R =0.999 9),在0.01,0.05,0.10,0.50 μg/mL和1.00 μg/mL 5个浓度添加水平上,平均回收率为77％～ 93％,样品的批内和批间变异系数均值
分别为5.29％和7.83％,定量限均为10 ng/mL.环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星检测限均为5 ng/mL,二氟沙星检测限为8 ng/mL.本研究建立的检测方法简单、快速、灵敏度和回收率高,适用于牛奶中4种氟喹诺酮类药物残留检测.
【期刊名称】《中国兽医杂志》
【年(卷),期】2018(054)003
【总页数】5页(P104-107,111)
【关键词】高效液相色谱;牛奶;氟喹诺酮类药物;残留
【作者】廖洁丹;李智丽;张济培;陈建红;杨鸿
【作者单位】佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东佛山528225;佛山科学
技术学院生命科学与工程学院,广东佛山528225;佛山科学技术学院生命科学与工
程学院,广东佛山528225;佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东佛山528225;佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东佛山528225
【正文语种】中文
【中图分类】S859.7
氟喹诺酮类(fluoroquinolones,FQs)是一类人工合成的抗菌药物,因其吸收好、组织浓度高、与其他药物交叉耐用性少等优点被广泛应用兽医临床和水产养殖。

由于人们对FQs药物的不合理使用以及不遵守该类药物的休药期,食品中残留低浓度的药物诱导人类致病菌耐药性逐年增加,FQs在动物性食品中的残留问题引起广泛关注,国内外研究报道了动物性食品中兽药残留分析方法[1-2]。

目前,牛奶中兽药残留的检测方法主要有微生物检测法[3]、分光光度法[4]、酶联免疫检测法[5-6]、胶体金免疫层析法[7]、高效液相色谱法[8-9]、高效液相色谱—质谱串联法[10]、毛细管电泳法[11]、适配体传感器检测法[12]等。

我国国家标准《牛奶中氟喹诺酮类药物多残留的测定(GB29692-2013)》由于需专业的操作人员,且受设备条件、实验成本和操作繁琐等限制,使其在国内较难普及[13]。

本研究旨在建立一种方法简单、快速、灵敏度高,同时满足检测牛奶中4种氟喹诺酮类药物残留的检测方法。

1 材料与方法
1.1 仪器与设备高效液相色谱仪(Agilent 1100)、电子分析天平、离心机、微型混合器、多功能振荡器、微量移液器等。

1.2 试剂恩诺沙星对照品(含量100.0%)、盐酸环丙沙星对照品(含量99.8%)、沙拉沙星对照品(含量99.6%),购自中国兽医药品监察所;二氟沙星原料药(含量100.6%),购自广州惠华有限公司;柠檬酸、乙酸铵、三乙胺、甲醇、正己烷(国产分析纯);乙腈(色谱纯,Fisher Scientific公司);提取液为65 μL磷酸 +4 mL甲醇溶液;
流动相:准确称取10.55 g柠檬酸和7.86 g乙酸铵,用去离子水溶解,加水稀释至1 000 mL,然后加三乙胺调pH值至2.4即为水相,水相与乙腈(85∶15,V/V)。

1.3 溶液配置
1.3.1 标准储备液称取恩诺沙星对照品0.0100 g和沙拉沙星对照品0.0110 g,分别用10%醋酸溶解后甲醇定容至10 mL;称取盐酸环丙沙星对照品0.0116 g和盐
酸二氟沙星原料药0.0099 g,分别用超纯水溶解后甲醇定容至10 mL;分别制得终
浓度为1 mg/mL的4种标准储备液。

1.3.2 混合标准工作液取以上4种标准储备液各1 mL,用甲醇稀释并定容制备终
浓度为100 μg/mL标准工作液Ⅰ。

取1 mL标准工作液Ⅰ,用甲醇稀释并定容制备终浓度为10 μg/mL的标准工作液Ⅱ。

取标准工作液Ⅱ,用甲醇稀释制备0.01
μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL 7 个系列浓度的混合氟喹诺酮标准工作液Ⅲ,存放于4℃冰箱。

1.4 色谱条件色谱柱 Hypersil BDS-C18(4.6 mm ×250 mm,5 μm);荧光检测器,激发波长(λex=278 nm),发射波长(λem=465 nm),流动相为 0.05 mol/L柠檬酸
/0.1 mol/L乙酸铵—乙腈(85∶15,V/V),使用前先用微孔滤膜过滤;柱温:40℃,流速1.0 mL/min,进样量 30 μL。

1.5 乳样品预处理准确吸取1 mL乳样品于15 mL塑料离心管中,加入100 μL混合氟喹诺酮的系列浓度标准工作液Ⅲ,旋涡混合器上混合30 s,静置30 min。

加入
65 μL磷酸+4 mL甲醇溶液,旋涡30 s以上;水平振荡30 min,静置5 min。

6 000 r/min离心6 min,将上清移至15 mL塑料离心管,残渣用65 μL磷酸和4 mL甲醇溶液再次提取后合并上清。

于上清中加入4 mL正己烷,旋涡混匀后静置5 min至
分层清晰,将上层弃掉。

剩余物78℃水浴,空气吹干。

上述残渣用1 mL流动相溶解并移至1.5 mL EP 管,12 000 r/min 离心6 min。

上清液用0.45 μm微孔滤膜过
滤后上机检测。

1.6 标准曲线及线性范围准确吸取1 mL空白乳样品置于8支塑料离心管中,取100 μL共7个系列浓度的混合氟喹诺酮标准工作液Ⅲ,旋涡混合30 s,静置30 min,其中第1管不加药物对照。

按1.5方法预处理,按1.4色谱条件从低浓度到高浓度测定,将测得的FQs药物的色谱峰面积(A)与相对应的药物浓度(C)作直线回归,求得标准曲线回归方程的线性范围。

1.7 检测限及定量限取牛奶空白乳样品进行添加回收试验,按照1.5乳样品前处理方法处理后进行HPLC分析。

以信噪比法(S/N≥10),且在该添加水平的回收率和变异系数均满足残留分析要求的最小浓度作为定量限(limit of quantity,LOQ);以信噪比法(S/N=3)作为药物的检测限(limit of detection,LOD),分别确定4种氟喹诺酮类药物的定量限和检测限。

1.8 准确度和精密度在1 mL空白乳汁样品中分别添加 5 个不同浓度(0.01
μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL)的 FQs药物标准工作液Ⅲ,按1.5乳样品处理方法,1.4色谱分析。

每个浓度做5个平行样品,同时进行空白对照,共做4个批次(日间),计算每个样品的回收率、批内和批间的变异系数。

2 结果与分析
2.1 标准曲线及线性范围添加氟喹诺酮系列标准工作液Ⅲ的乳样品按1.5方法预处理,按1.4色谱条件测定,乳样品中4种FQs药物与样品中其他成分有效分离。

将FQs药物的色谱峰面积(A)与相对应的药物浓度(C)作直线回归,求得标准曲线回归方程的线性范围为0.01～1.00 μg/mL内呈良好的线性关系(R=0.999 9),结果见图1。

图1 4种氟喹诺酮类药物标准曲线图
2.2 色谱图空白乳样品按1.5方法预处理,按1.4色谱条件检测。

结果表明,空白乳样品对4种氟喹诺酮类药物的对应保留时间处所测的分析物均无干扰。

图2～图
4分别是空白乳样品、FQs药物混合标准品(0.10 μg/mL)及添加 FQs药物乳样品(0.10 μg/mL)的色谱图。

本试验在1 L流动相中加入1 mL三乙胺调pH值至2.4,消除FQs药物的两性化合物中硅羟基的影响,抑制其解离,改善峰形。

由色谱图可见,预处理后乳样品各组分分离度较佳,色谱峰形好且保留时间合理,出峰时间分别为环
丙沙星 6.621 min、恩诺沙星9.684 min、沙拉沙星 12.883 min、二氟沙星
15.731 min。

图2 空白乳样品色谱图
图3 FQs标准品(100 ng/mL)色谱图
图4 牛奶中添加FQs(100 ng/mL)色谱图(6.621 min—环丙沙星、9.684 min—恩诺沙星、12.883 min—沙拉沙星、15.731 min—二氟沙星)
2.3 检测限及定量限按照S/N=3计算,环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星在牛奶中的检测限均为5 ng/mL,二氟沙星在牛奶中的检测限为8 ng/mL。

在空白乳汁样品中分别添加5个浓度(0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL)的FQs药物标准溶液,每种浓度5个样品,按1.5乳样品处理后HPLC
检测。

结果显示,牛奶中4种FQs药物的添加浓度为10 ng/mL时,S/N≥10,且回收率均大于87%,变异系数小9.84%。

因此,环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星定量限均为10 ng/mL。

2.4 准确度和精密度采用添加法选取5种不同添加浓度
(0.01,0.05,0.10,0.50,1.00 μg/mL),以上5种浓度包含4种FQs药物残留检测的要求。

每种浓度5个样品,重复4批次。

测定结果显示,牛奶乳样品中环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星的回收率分别为80% ～92%,77% ～91%,81% ～93%,78% ～88%。

本方法的批内、批间的变异系数均值分别为5.29%和7.83%。

结果表明,本研究建立的检测方法准确度和精密度良好。

3 讨论
3.1 色谱条件的优化色谱分析法是检测牛奶中兽药残留的常用方法[4],国内学者也对牛奶中FQs药物多残留检测进行相关研究报道[13-15]。

由于FQs在食品和环境中残留量极低,建立高灵敏度和准确度的分析方法是检测的关键,选择合适的色谱操作条件至关重要。

柱温、流动相组份的比例以及流速等都直接影响柱压,从而改变了样品组份的保留时间。

本试验发现室温条件下色谱峰形欠佳且分离度不完全,40℃ 柱温效果最佳。

因为FQs药物在酸性条件下荧光强度较高,且出峰时间对乙腈敏感,本研究的流动相水相选用0.05 mol/L柠檬酸-0.1 mol/L乙酸铵并用三乙胺调整pH值为2.4改善峰形,尝试14%,15%,16%,17%,18%乙腈浓度避开样品中的干扰峰,乙腈比例加大药物出峰时间前移。

结果表明,选用上述水相和15%乙腈为有机相可在17 min内完成样品中4种氟喹诺酮类药物残留检测,与杨勇等[13]报道的测定牛奶中6种氟喹诺酮类药物残留方法比较,缩短了样品检测时间且分离度最佳。

此外,为了避免各组织样品提取液中的微量蛋白、脂肪等物质缩短色谱柱的寿命,我们在色谱分析柱前加C18保护柱进行保护。

3.2 样品前处理方法的选择牛奶中含有大量的脂类、蛋白质等干扰物质影响色谱分离和检测,样品前处理方法的选择与药物残留的种类、检测手段以及样品基质复杂程度有关[16],是检测分析的关键步骤[17]。

迄今为止,沉淀法、液液萃取和固相萃取[17-18]是较为常用的样品前处理技术,固相微萃取和分子印迹固相萃取联用[19]、基质固相分散萃取[17]、超临界流体萃取[20]、Qu ECh ERS 技术[17,21-23]在药物多残留分析方面的应用范围也逐渐扩大。

近年来,浊点萃取(Cloud Point Extraction,CPE)技术也逐步应用于牛奶中FQs药物的残留检测[24-25]。

本研究曾用乙腈-10%三氯乙酸(3∶7,V/V)为提取液,通过SPE净化后浓缩上样,结果发现回收率和定量限与磷酸-甲醇提取液提取效果类似,但因SPE柱净化成本较高,操作者熟练程度会影响样品的回收率以及变异系数,最终选择了后者作为前处理方法。

本研究也在提取液的用量以及提取次数比较其回收率,结果表明,提取液
为3 mL时回收率偏低,4 mL与6 mL无明显差别,提取两次的回收率较高,最终选用了65 μL磷酸与4 mL甲醇提取两次后挥干定容。

本试验建立的氟喹诺酮类药物多残留检测方法比已报道的牛奶中FQs药物残留检
测相比较[14,26]具更高的准确度和精密度。

因此,本试验建立的残留检测方法简单、快速、灵敏度高、准确度和精密度好,适用于牛奶中4种氟喹诺酮类药物残留检测。

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