腐烂茎线虫不同地理种群ITS区序列比对及系统发育

文章编号:1000-1573(2007)05-0079-05
腐烂茎线虫不同地理种群IT S 区
序列比对及系统发育
王金成1, 季 镭2, 黄国明1, 杨秀丽1, 林茂松2
(1.天津出入境检验检疫局,天津300456; 2.南京农业大学植病系,江苏南京210095)
摘要:为弄清我国腐烂茎线虫(Ditylenchus destr uctor )不同地理种群IT S(I nternal transcr ibed spacer)区之间的碱基差异及系统发育关系,本研究通过网络软件Clustalw 1.83对腐烂茎线虫的核糖体I T S 区核酸序列进行了比对,结果发现腐烂茎线虫的8个种群中,DEll 、DEly 、DEAY987007三个种群(I 组)内部之间的碱基差异在1%以内,其它的5个种群(II 组)之间的差异为0~1%,而I 组与I I 组种群之间的差异达到了15%(根据IT S1+ 5.8s +IT S2序列)或20%(根据IT S1+IT S2序列)。

这说明我国腐烂茎线虫很可能是1个复合种。

根据IT S 区核酸序列构建的系统发育图同样显示,我国腐烂茎线虫的7个地理种群明显分为2个分支A 和B 。

关 键 词:腐烂茎线虫;鳞球茎茎线虫;食菌茎线虫;IT S(Inter nal transcribed spacer);系统发育关系中图分类号:S 435.621.2+9
文献标识码:A
Alignments of rDNA -ITS sequences and phylogeny of different
geo populations of Ditylenchus destructor in China
WAN G Jin cheng 1,JI Lei 2,HU ANG Gu o ming 1,YAN G Xiu li 1,LIN Mao song 2
(1.T ianjin Entr y-Exit Inspection and Quar antine Bureau,T ianjin 300456,China;2.Dept.of Plant P atholog y,N anjing A gricultural U niversity ,N anjing 210095,China)
Abstract :The IT S sequences of 8populations of sw eet potato stem nematode,Ditylenchus destr uctor ,w ere analyzed.The pair-w ise divergences for IT S1+ITS2sequences and IT S1+5.8s +IT S2sequences of 3populations (group I),DEll,DEly and DEAY987007,are w ithin 1%.T he pair-w ise divergence w ithin other 5populations (group II),DEjl,DEsg ,DEws,DEw y,DEhblf,varied from 0~1%.However,the divergence betw een group I and group II is 15%for ITS1+5 8s+ITS2sequences or 20%for ITS1+IT S2sequences.T he MP analysis divided the 8above-mentioned populations into tw o clades.The clade B includes DEll,DEly and DEAY987007(group I),and the other 5populations in group II belong to clade A.
Key words:Ditylenchus destr uctor ; D.dip saci; D.myceliop hagus;ITS (Internal Transcribed Spacer);phy logenetic relationships
收稿日期:2006-11-10
基金项目:天津自然科学基金资助项目(05YF JM JC10800)
作者简介:王金成(1978-),男,山东潍坊人,硕士,农艺师,主要从事植物线虫方面的研究.E mail:goldcit ywang @yahoo.
通讯作者:林茂松(1948-),男,江苏徐州人,博士,教授,主要从事植物线虫方面的研究.
E mail:linms@
第30卷第5期2007年9月
河北农业大学学报
JOURNAL OF AGRICULT URAL UNIVERSIT Y OF H EBE I
Vol.30No.5Sep .2007
腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为农业上重要病原线虫,也是我国重要的植物检疫性有害生物。

该线虫目前在我国河北、山东、山西、安徽、江苏和天津等省市的甘薯上均有发现。

ITS(Internal transcribed spacer)区位于核糖体18s rDNA基因和28s rDNA基因之间,是一段高度重复的核酸序列,易于扩增,并且与核糖体基因之间存在协同进化的现象[1],因此是一条理想的分子生物学研究的目标片段。

目前,利用IT S区核酸序列对植物线虫进行系统发育研究的报道较少[2-3]。

本研究利用线虫ITS区通用引物对7个腐烂茎线虫种群、2个鳞球茎茎线虫种群以及1个食菌茎线虫种群的ITS区进行了扩增和测序,并根据ITS区的测序结果,以鳞球茎茎线虫D.dip saci和食菌茎线虫D.myceliop hagus作外源构建了腐烂茎线虫的系统发育树,其目的就是试图弄清我国腐烂茎线虫不同地理种群之间的亲缘和进化关系。

1 材料与方法
1.1 材料1.1.1 线虫种群 腐烂茎线虫(D.destr uctor)分别来自河北、江苏、山西、山东、安徽等5省的病区,从病薯中分离得到[4]。

鳞球茎茎线虫(D.dipsaci)由江苏出入境检验检疫局提供,分别截获于来自希腊和意大利货轮,寄主为大蒜。

食菌茎线虫(D. myceliop hagus)来自浙江温州病区,从蘑菇培养基中分离获得(见表1)。

所有上述种群均根据形态特征和虫体测量数据进行了初步的鉴定[5]。

另外,本研究还使用了GenBank/EM BL/DDBJ基因库中鳞球茎茎线虫的5条ITS序列以及1条腐烂茎线虫的ITS序列。

1.1.2 引物 本试验采用线虫ITS区通用引物参照Ferris等[6]和Vrain等[7]设计的引物:
上游引物P1:5-CGT AAC AAG GTA GCT GTA G-3
下游引物P2:5-TTT CAC T CG CCG TTA CTA AGG-3
引物由Invitrog en公司合成。

表1 供试线虫样品及来源Table1 Samples used in the study
序号N o.样品编号
Code
种名
Species name
中文名
Chinese name
来源
Orig in
1DEly D.destr uctor腐烂茎线虫山东沂水(AM232233) 2DEll D.destr uctor腐烂茎线虫山东临沂(AM232232) 3DEw s D.destr uctor腐烂茎线虫安徽泗县(AM232228) 4DEw y D.destr uctor腐烂茎线虫安徽颖上(AM232229) 5DEjl D.destr uctor腐烂茎线虫山西临汾(AM232231) 6DEsg D.destr uctor腐烂茎线虫江苏赣渝(AM232227) 7DEhblf D.destr uctor腐烂茎线虫河北廊坊(AM232230) 8DEA Y987007 D.destr uctor腐烂茎线虫俄罗斯莫斯科(A Y987007) 9DII T D.dip saci鳞球茎茎线虫意大利(AM232235) 10DIGR D.dip saci鳞球茎茎线虫希腊(AM232234)
11DIAF396319 D.dip saci鳞球茎茎线虫爱沙尼亚E(AF396319) 12DIAF396320 D.dip saci鳞球茎茎线虫爱沙尼亚(AF396320) 13DIAF396321 D.dip saci鳞球茎茎线虫俄罗斯莫斯科(A F396321) 14DIAF396322 D.dip saci鳞球茎茎线虫俄罗斯莫斯科(A F396322) 15DIAF396323 D.dip saci鳞球茎茎线虫摩洛哥(AF396323)
16DM zw D.my celiop hagus食菌茎线虫浙江温州(AM232236)
注:括号内为各条序列在GenBank/EM BL/DDBJ基因库中的索取号.
1.2 方法
1.2.1 线虫DNA的提取 DNA提取方法参照王金成等[8]的方法进行。

在洁净的载玻片上加8 L 去离子水,用挑针挑入一条去离子水洗过的线虫,用解剖刀将线虫切成2~3段,最后将切碎的线虫连同8 L去离子水转入200 LPCR反应管中。

在上述管中分别加入1 L PCR缓冲液(10!Buffer)和1 L蛋白酶K(1mg/mL),混匀,-20∀冷冻过夜,然后65∀保温1h,最后94∀灭活10 min,离心后上清液可直接用于PCR扩增。

所用10!PCR缓冲液和蛋白酶K购自Inv itrogen公司。

1.2.2 PCR扩增
(1)PCR反应体系。

反应总体积50 L:ddH2O
80
河北农业大学学报第30卷
28 6 L,10!PCR Buffer (M g 2+)5 L,dNT P (2 5mmol)2 L,上游引物(10 mol/L)3 L,下游引物(10 mol/L)3 L,Taq DNA 聚合酶(5U/ L)0 4 L,模板DNA 8 L 。

所用试剂均购自大连宝生物(TAKARA)公司。

(2)PCR 反应条件。

反应条件:95∀预变性3m in,然后是40个循环反应(95∀变性30sec,55∀退火30sec,72∀延伸1min ),最后72∀保温10min,使反应物充分延伸。

(3)PCR 产物电泳检测。

PCR 反应结束后,在1 5%的琼脂糖凝胶上电泳,所用电压120V 。

1.2.3 PCR 产物测序和序列比对 当扩增获得的PCR 产物浓度达到100ng / L 时,交由Invitrogen 公司测序。

每一份PCR 产物都采用正反双向测序,然后将2次测序结果进行拼接,剪掉核糖体18s 和28s rDNA 基因序列,最后将ITS 序列用于序列比对分析。

序列比对通过网络软件Clustalw 1.83(http://w w /clustalw )进行。

1.2.4 系统发育关系研究 以DNA 序列推断系统发育关系的程序是: 选择一段合适的分子标记,如rDNA -ITS 序列;#测序;∃通过比对(Alig nment)获得矩阵;%选择一种算法搜索最优分支图[9]。

本研究在对腐烂茎线虫共8个种群的ITS 序列进行分析以获得其系统发育关系图时所使用的软件是MEGA3。

软件M EGA3可在网站/sc/0195135857上获得。

2 结果与分析
2.1 PCR 产物检测结果
3种茎线虫PCR 产物的大小除了来自山东的2个腐烂茎线虫种群DEll 和DEly 大约为1000bp 外,其它5个腐烂线虫种群PCR 产物大小与2个鳞球茎茎线虫种群和1个食菌茎线虫种群相当,为800bp 左右(图1)。

1~10依次为:DIIT 、DIGR 、DM zw 、DEjl 、DEsg 、DEw s 、DEw y 、DEhblf 、DEly 、DEll 的PCR 产物;M :M arker(从上到下依次为:1 5、1 0、0 9、0 8、0 7、0 6、0 5、0 4、0 3、0 2、0 1kbp)
图1 PC R 扩增产物
Fig.1 PCR amplification product
因此,从PCR 产物的大小来看,来自山东的腐烂茎线虫DEll 和DEly 与其它来源的5个腐烂茎线虫种群相比差异明显(图1)。

2.2 核糖体ITS 区序列比较结果
将ITS1和ITS2拼接后进行比较分析,发现腐烂茎线虫种内碱基差异在0~20%之间,鳞球茎茎线虫种内碱基差异在1%~7%之间;就种间差异而言,鳞球茎茎线虫与腐烂茎线虫碱基差异在59%~69%之间,鳞球茎茎线虫与食菌茎线虫的差异在65%~66%之间,腐烂茎线虫与食菌茎线虫的碱基差异在17%~49%之间。

就腐烂茎线虫的8个种群而言,来自山东的DEll 、DEly 和俄罗斯的种群DEAY987007之间的差异在1%以内,其它的5个种群之间的差异为0~1%,而DEll 、DEly 和俄罗斯种群与其它5个腐烂茎线虫种群之间的差异达到了20%。

而如果将ITS1、5 8s rDNA 和ITS2拼接进行分析,结果发现鳞球茎茎线虫种内碱基差异在1%~6%之间,腐烂茎线虫种内差异在0~15%之间;就种间碱基差异来说,鳞球茎茎线虫与腐烂茎线虫的差异在47%~56%之间,鳞球茎茎线虫与食菌茎线虫的差异在49%~50%之间,腐烂茎线虫与食菌茎线虫的差异在13%~25%之间。

腐烂茎线虫的8个种群中,来自山东的DEll 、DEly 和俄罗斯种群DEAY987007之间的差异在1%以内,其它的5个种群之间的差异为0~1%,而DEll 、DEly 和俄罗斯种群与其它5个腐烂茎线虫种群之间的差异达到了15%。

从ITS 区序列比较来看,剪除5 8s rDNA 序列在一定程度上会放大了不同线虫种群之间的碱基差异水平。

同时,从碱基差异也可以看出,我国腐烂茎线虫很可能是1个至少由2种线虫组成的复合种。

碱基序列比对显示,我国腐烂茎线虫的优势种群(以DEhblf 为代表)与山东种群(以Dell 为代表)的主要差别在于我国腐烂茎线虫的优势种群在ITS1区,即下划线部分缺失了一段188bp 的核酸序列以及5个碱基的差异。

而ITS2区仅有7个碱基的差异(图2)。

81
第5期 王金成等:腐烂茎线虫不同地理种群ITS 区序列比对及系统发育
&.∋:碱基相同;&-∋:碱基缺失
图2 我国优势种群与山东种群之间的序列比对Fig.2 Sequences alignment between DEhblf and D ell
2.3 系统发育关系
在系统发育分析中,以7个鳞球茎茎线虫种群以及1个食菌茎线虫种群的ITS1和IT S2序列作为外源序列。

根据ITS1和ITS2序列获得的结果来看,腐烂茎线虫和食菌茎线虫之间有更近的亲缘关系,而与鳞球茎茎线虫之间的亲缘关系更远。

腐烂茎线虫8个种群在进化上分成2个分支,即山东的2个种群DEll、DEly和来自俄罗斯的1个种群DEAY987007与其它5个腐烂茎线虫种群发生分化,形成2个个独立的分支A和B(图3)。

82
河北农业大学学报第30卷
图3 根据ITS1和ITS2构建的的系统发育树(最大简约法,自展检验中重复抽样次数为1000次)Fig.3 Phylogenetic tree (MP algorithm )based
on ITS1and ITS2sequences
根据ITS1、5 8s rDNA 和ITS2序列获得的结果(图4),5 8s rDNA 序列的存在并不会在本质上影响到系统发育树的分支状况,但会影响到分支的长度。

因此,在实际的研究中,在根据ITS 序列进行系统发育分析时,应特别注明是否保留了ITS1和ITS2之间的5 8s rDNA
序列。

图4 根据ITS1、5.8s rRNA 和ITS2构建的系统发育树(最大简约法,自展检验中重复抽样次数为1000次)Fig.4 Phylogenetic tree (MP algorithm)based on
ITS1, 5.8s rRNA and ITS2sequences
3 讨论
Pow ers 等
[1]
认为,生物的内部转录间隔区
(ITS),基因间间隔区(IGS)以及核糖体基因之间存在协同进化的现象,所以IT S 区可应用于构建系统发育树和确定生物的分类地位等领域。

从线虫的核糖体ITS 区序列比较以及它们的系统发育关系图可以发现,腐烂茎线虫和鳞球茎茎线虫不同地理种群间都发生了不同程度的分化,但相比之下,腐烂茎线虫地理种群间分化更加显著,尤其是来自山东的种群DEll 、DEly 和俄罗斯的种群DEAY987007,由于和其它的5个腐烂茎线虫种群之间的遗传差异已
经达到种的水平,所以我国的腐烂茎线虫很可能是一个包含至少两种线虫的复合种,这与以往仅仅依赖形态特征得出的结论不同[10]。

因此,应在我国腐烂线虫的生殖隔离、寄主范围及致病性等方面做更加深入的研究,以明确我国腐烂线虫复合种的地位是否成立。

根据ITS 区序列比较,我国山东的2个种群DEll 和DEly 与来自俄罗斯莫斯科地区的DEAY987007最为接近,同源性达到99%以上。

系
统发育同样显示DEll 、DEly 和DEAY987007三者亲缘关系最近。

这说明,山东的种群DEll 和DEly 为真正意义上的腐烂茎线虫Dity lenchus destructor,而在系统发育中分支A 中的5个种群则是我国甘薯中更为常见的另一个线虫新种。

在生物学习性上,食菌茎线虫寄生低等的菌类,鳞球茎茎线虫的寄主为高等的植物,而腐烂茎线虫则在没有植物寄主的情况下,可以取食土壤真菌存活[10]。

根据系统发育图可推断分支A 的5个线虫种群很可能与腐烂茎线虫有相似的生物学习性,也就是说分支A 中的线虫种群很可能不仅能够寄生高等的植物而且可取食土壤真菌存活。

本文研究结果认为腐烂茎线虫与食菌茎线虫有更近的亲缘关系,而与鳞球茎茎线虫间的亲缘关系较远。

一种可接受的解释是,这3种线虫的古老的祖先为食菌线虫,在进化的过程中鳞球茎茎线虫获得对高等植物的寄生能力而分化出来,之后腐烂茎线虫也获得了寄生高等植物的能力同时保留了部分祖先的特性,而食菌茎线虫则获得了对较高等菌类
的寄生能力。

根据线虫的DNA 序列进行系统发育研究能够在一定程度上避免人为因素造成的偏差,比如,不同的研究者在形态学指标的选择上可能存在很大差异。

在本研究中,通过所获得的系统发育图来看,ITS 序列在用于茎属的腐烂茎线虫、鳞球茎茎线虫和食菌茎线虫的研究中可以得出有意义的结论,但ITS 序列在茎属更多线虫以及其它属线虫的系统发育分析中是否同样具有意义还需要做更多细致的研究工作。

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(下转第98页)
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第5期 王金成等:腐烂茎线虫不同地理种群ITS 区序列比对及系统发育
星、氟苯尼考、庆大霉素、环丙沙星、链霉素、阿米卡星、新霉素。

各地区用药种类多,用法不规范,存在严重滥用药物现象,这是导致多重耐药性产生的根本原因。

同为常用药,但耐药率又有所不同,这与当地用药习惯及用药时间长短有关,如四环素、庆大霉素和阿莫西林,在兽医临床上使用时间较长,耐药基因的传递作用使这些药物表现出较高的耐药率。

同类药物耐药性相似,如氟喹诺酮类,主要是由于细菌对同类药物的耐药机理一致,对常用药物诺氟沙星和环丙沙星的耐药性出现,必将引起对其他氟喹诺酮类药物出现完全或不完全交叉耐药性。

抗菌药物耐药性的监测不仅为指导临床合理用药提供了依据,还可为大肠杆菌多重耐药性产生机理的研究奠定前期基础,以减缓细菌耐药性的产生。

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(编辑:李 川)
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98
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