RP-HPLC法测定血浆中奥卡西平及其活性代谢物浓度

2021年第10期广东化工
第48卷总第444期·231·RP-HPLC法测定血浆中奥卡西平
及其活性代谢物浓度
刘东平，谢海燕
(南京鼓楼医院集团安庆市石化医院药剂科，安徽安庆246001)
Determination of the Concentration of Oxcarbazepine and
Its Active Metabolites in Human Plasma by RP-HPLC
Liu Dongping,Xie Haiyan
(Pharmacy Department,Anqing Shihua Hospital of Nanjing Drum Tower Hospital Group,Anqing246001,China) Abstract:Objective:To establish a method for determining the concentration of Oxcarbazepine(OXC)and its active metabolite10,11-Dihydro-10-hydroxy Carbamzepine(MHD)in human plasma.Methods:We used Alprzolam as the internal standard,Plasma samples were detected by RP-HPLC after being processed by Methyl t-Butyl Ether,using a mobile phase of CH3CN-H2O(45︰55,v/v)at the flow rate of1.0mL/min.The temperature was40℃,detection wavelength was220 nm and sensitivity was0.01AUFS.Results:There was a good linear relationship in the concentration of OXC respectively in the range of0.28~4.48µg/mL and MHD respectively in the range of2.40~38.40µg/mL,the lowest limit of detection was0.35µg/mL and1.20µg/mL.The relative average recoveries of low,middle and high concentration were respectively83.23%~103.17%and87.99%~116.07%;the RSD of intra-day(n=3)and inter-day(n=5)variation were less than10%. Conclusions:The method is sensitive,accurate,easy and quick.That can be used for therapeutic drug monitoring(TDM)and pharmacokinetics studies.
Keywords:OXC；MHD；therapeutic drug monitoring(TDM)；RP-HPLC
奥卡西平(Oxcarbazepine,OXC)是卡马西平的10－酮基结构
类似物，为前体药，在体内迅速被代谢为有药理活性的10-羟基代
谢物(10-monohydroxy metaboliute，MHD)[1]，即10,11-二氢-10-羟
基卡马西平(10,11-Dihydro-10-hydroxy Carbamazepine)。

MHD在
体内发挥抗癫痫和治疗全身强直性阵孪性发作的作用。

可阻断脑
细胞的电压依赖性钠通道，稳定过度兴奋的神经细胞膜，抑制神经元过度放电，降低经突触传递的兴奋冲动。

药理作用与临床疗
效与卡马西平相似，且易于耐受，尤其在婴幼儿用药中更为明显。

在临床使用中，OXC与MHD和其他AEDs药物一样具有合适的
治疗窗、存在一定毒副作用的问题。

鉴于不同患者的代谢差异、
疗效差别、不良反应表现、药动学参数的不同等个体差异的原因，
在临床使用中对OXC与MHD进行治疗药物监测(Therapeutics Drug Monitoring，TDM)具有重要的临床意义，用于个体化治疗方案的设计，更有利于疾病的治疗与控制。

本实验结合我院实验室
条件，建立一种灵敏、准确、简便、快速的测定血浆中OXC与MHD浓度的高效液相色谱法，测定血药浓度，协助临床合理用药。

1材料
1.1仪器
日本岛津高效液相色谱仪，包括LC-20AD四元泵、DGU-20A5在线脱气机、SPD-20AV紫外检测器、CTO-20A可调柱温恒温箱及LC solution色谱工作站。

万分之一电光分析天平(上海天平仪器厂)、800D电动离心机(常州医科诺仪器有限公司)、MDF-382E超低温冰箱(日本三洋电机生物医学有限公司)、电热恒温水浴锅(上海跃进医疗仪器厂)。

1.2药品与试剂
奥卡西平化学对照品(C15H12N2O2中国药品生物制品检定所，批号100657-200401)；10,11-二氢-10-羟基卡马西平化学对照品(C15H14N2O2加拿大TORONTO RESEARCH CHEMICALS INC，批号204483)；阿普唑仑化学对照品(C17H13ClN4国家麻醉药品实验室，批号1218-9702)。

甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚均为色谱纯(美国TEDIA公司)，水为0.45µm微孔滤膜过滤注射用水。

2方法与结果
2.1色谱条件
A：空白血浆色谱图；B：空白血浆+OXC+MHD+内标色谱图；C、D：患者血样+内标色谱图
1－MHD；2－OXC；3－阿普唑仑
图1高效液相色谱图
Fig.1High performance liquid chromatography
[收稿日期]2021-04-14
[作者简介]刘东平(1972-)，男，安徽安庆人，大学本科，主要研究方向为医院药学，临床药学，药事管理。

广东化工2021年第10期·232·第48卷总第444期
色谱柱：Kromasil TM C18(150mm×4.6mm，5µm)反相色谱柱；流动相：乙腈-水(45︰50，V/V)，流速1.0mL/min，检测波长220 nm，柱温40℃，灵敏度为0.01AUFS。

在该色谱条件下，空白血浆、OXC与MHD对照品血浆以及癫痫患者服药后血浆样本，用甲基叔丁基醚萃取、分离，65℃水浴、N2吹干，流动相溶解、进样，经HPLC检测分析，得到色谱图(见图1)。

由图1可知，内标、OXC和MHD色谱峰分离完好，无明显内生杂质峰干扰，本方法具有较高的专属性。

OXC、MHD、内标阿普唑仑保留时间分别为2.728min、4.239min、6.991min。

2.2标准溶液配制
经电光分析天平精密称取OXC化学对照品3.5mg，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至50mL，配制成含OXC70.0µg/mL的标准溶液；精神称取MHD化学对照品3.0mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至25mL，配制成含MHD 120.0µg/mL的标准溶液；精密称取阿普唑仑化学标准品10.0mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至50mL，配制成含阿普唑仑200.0µg/mL的标准溶液作为内标溶液备用。

2.3血浆样品处理
服用OXC一周后的患者空腹血浆500µL加至15mL具塞锥形玻璃离心管中，精密加入内标溶液10µL，涡旋振荡30s。

加入甲基叔丁基醚5mL，密塞，涡旋振荡3min。

于离心机中以4000 rpm转速离心4min，静置后移取上清液至10mL锥形离心管中。

于恒温水浴锅中65℃水浴，于N2流吹干。

进样前加100µL流动相快速振摇数秒溶解样品，吸取20µL进样。

2.4干扰性试验
临床治疗癫痫疾病时常采用联合用药方式，本试验取常用的抗癫痫药苯妥英钠、苯巴比妥、拉莫三嗪、丙戊酸钠、卡马西平、氯硝西泮、地西泮、硝西泮、艾司唑仑等药物。

按“2.3”实验条件进样检测，发现有部分药物可干扰本实验测定，与内标物阿普唑仑吸收峰部分重叠，如卡马西平、氯硝西泮、硝西泮、艾司唑仑等。

因此在实验进行前需仔细查询患者服药情况，如患者有联合使用存在干扰实验检测的药物，需进行规避。

此时可选用替代内标物进行实验，如地西泮。

2.5标准曲线绘制
取16支15mL具塞玻璃离心管。

在1支离心管中加入OXC
标准溶液25µL+MHD标准溶液50µL+内标阿普唑仑溶液10µL，另加入空白血浆500µL，涡旋混匀，配制成含OXC浓度(C s)为3.50µg/mL+MHD浓度(C s)为12.0µg/mL的基准样本。

另15支离心管各加入10µL阿普唑仑溶液，再各加入不同体积的OXC标准溶液和MHD标准溶液和空白血浆500µL，配制成含OXC浓度分别为0.70、1.40、2.80、5.60、11.20µg/mL；MHD浓度分别为2.40、4.80、9.60、19.20、38.40µg/mL的待测样本。

每个浓度样本做3次进行比对。

按“2.3”实验条件进行检测，经HPLC法分
析，测得基准血浆样本中的OXC、MHD吸收峰面积(A
基i
)和阿普
唑仑吸收峰面积(A
基s
)，算出参比值R基=A基i/A基s。

每个血浆样本
经分析测得样本中的OXC、MHD吸收峰面积(A
样i
)和阿普唑仑吸
收峰面积(A
样s
)，算出参比值R样＝A样i/A样s。

结果算出每出样本
中的OXC和MHD浓度，依据公式C=R
样/
R基×C s。

以加样理论值(C)为横坐标，以同水平平均浓度(C x)为纵坐标绘制标准曲线。

经最小二乘法线性回归，得到回归方程分别为：y OXC=0.9606x-0.0055(r=0.9991)、y MHD=0.8555x+0.4956(r=0.9985)。

结果表明，OXC血浆浓度在0.70~11.20µg/mL、MHD血浆浓度在2.40~38.40µg/mL范围内线性关系良好。

当信噪比为3时，OXC 检测定量下限可达0.35µg/mL、MHD检测定量下限可达1.20µg/mL。

2.6回收率及精密度试验
按“2.5”项内各浓度实测值平均数与理论加样浓度值比较，计算各浓度时方法回收率，OXC各浓度方法回收率为83.23%~103.17%；MHD各浓度方法回收率为87.99%~116.07%。

同时算得两者的日内精密度RSD均不大于10%。

在一周内每天一次按“2.5”项方法分别配制含OXC浓度分别为0.70、1.40、2.80、5.60、11.20µg/mL和含MHD浓度分别为2.40、4.80、9.60、19.20、38.40µg/mL的血浆样本，按“2.3”项实验方法处理，进样测定。

所测得各物质吸收峰积分值，按“2.6”项方法，与基准血样各物质吸收峰积分值参比计算各血样实测浓度值，计算五日内两者的日间精密度RSD均不大于10%。

结果表明，本实验方法符合人体生物样本分析要求。

回收率及精密度试验结果见表1。

表1回收率及精密度试验结果Tab.1Results of recovery rate and precision test
药物加入量/(µg/mL)
日内精密度(n=3)
方法回收率/%
日间精密度(n=5)
平均值/(µg/mL)RSD/%平均值/(µg/mL)RSD/%
OXC 0.700.7228.50103.170.645 4.48
1.40 1.1658.5283.23 1.337 6.40
2.80 2.644 5.0294.43 2.730 4.79 5.60 5.635 2.89100.63 5.6998.96 11.2010.651 6.4695.1010.448 6.27
MHD 2.40 2.786 4.91116.07 2.363 6.75 4.80 4.5829.4795.46 4.683 5.17 9.609.208 6.0995.919.141 4.43 19.2015.760 6.2493.8117.966 3.31 38.4033.7887.7087.9939.6087.94
2.7样品稳定性试验
按“2.5”项方法分别配制OXC低、中、高质量浓度(0.70、2.80、11.20µg/mL)+MHD低、中、高质量浓度(2.40、9.60、38.40µg/mL)三组45个样本(每组低、中、高各5个)，每组分别在室温(18~25℃)放置0、5h，-20℃冻存1d，-20℃冻存1w、3w后进行测定，未见室温及冻存样本的药物降解。

统计结果RSD均不大于15%。

结果见表2。

2.8临床应用
选择在我院就诊并使用奥卡西平片(曲莱®，0.15g/片诺华制药)的癫痫患者，服药一周后早晨服药前采血检测其血浆药物浓度。

部分患者服药后的血药浓度见表3。

表2OXC与MHD稳定性试验结果Tab.2Results of stability test by OXC and MHD
药物加入量/(µg/mL)
室温0h室温5h-20℃冻存1d-20℃冻存1w-20℃冻存3w 检测值RSD检测值RSD检测值RSD检测值RSD检测值RSD µg/mL%µg/mL%µg/mL%µg/mL%µg/mL%
OXC
0.700.698 4.930.694 5.830.6627.470.6739.610.6737.34 2.80 2.752 2.31 2.610 2.74 2.796 4.27 2.737 6.30 2.86811.33 11.2010.25810.9411.0019.659.92013.449.78810.2310.26810.29
MHD 2.40 2.396 2.58 2.385 5.26 2.307 6.65 2.31811.97 2.3088.00 9.609.326 5.669.668 3.919.4687.119.075 5.999.027 6.65 38.4038.4387.4439.446 6.5538.298 5.9737.0218.8639.0337.71
2021年第10期广东化工
第48卷总第444期·233·表3部分患者服用OXC后的血液药物浓度
Tab.3Plasma concentrations of some patients
after administration of OXC
患者性别年龄服药量实测浓度/(µg/mL)岁g/d OXC MHD
1男50.30 2.08418.664
2男15 1.20 1.28317.724
3男18 1.20 1.93114.426
4女70.60 1.59111.688
5女280.600.8047.726
6女680.600.725 6.698
1.20 1.23920.661
7男370.90 1.47011.246
8男620.60 1.2978.820
9女53 1.20 1.59812.476
10男36 1.20 1.09810.796
3讨论
3.1检测的必要性和目标
OXC作为一种新型抗癫痫药物，临床用于治疗儿童及成人部分发作或继发全面性发作的药物。

OXC在使用过程中可能存在一些药物不良反应[2-4]，容易诱导低钠血症。

在撤除或停药时容易导致短暂性发作加剧，甚至出现癫痫持续状态[5]。

为控制癫痫发作及保证治疗效果，对OXC及MHD进行血药浓度监测实有必要。

MHD谷浓度有效治疗窗参考范围为5~20µg/mL[6]，在此有效治疗范围可以保证癫痫的有效控制和减少药物不良反应的发生。

当MHD血浆浓度＞30µg/mL时，更容易诱导药物不良反应的发生[7]。

3.2试验方法的选择
本实验根据药物的化学特性及在特定溶剂中的溶解性，采用经典的液－液提取法，适合于HPLC法检测[8]。

具有操作方法简便、快速，成本低廉的优点；采用内标法检测，尽量减少实验操作中产生的误差，使相对回收率接近100%，日内、日间RSD均小于10%，标本贮存后的稳定性考察RSD小于15%，符合《临床药动学试验指导原则》的基本要求，结果可靠。

3.3检测波长选择
OXC与MHD化学对照品溶液在190~370nm波长范围内此外扫描发现[9]，二者在190~282nm波长范围内有较好吸收，且在210nm处均有最大吸收值，但210nm波长靠近末端吸收，对检测干扰大，易受溶剂甲醇的影响而造成基线的波动。

根据波长扫描的结果，选择次高吸收值位置的220nm作为检测波长进行实验，取得良好的效果，在此波长处检测，基线稳定，峰形理想，避免干扰，检测各组分的响应值较高。

3.4线性范围
OXC在肝脏细胞内还原酶作用下迅速转化为MHD。

OXC在成年癫痫患者体内的稳态浓度较低，仅为0.15~1.32µg/mL[10]，基本不能体现治疗效应。

MHD的稳态谷浓度可达2.6~16.2µg/mL，确定MHD的治疗窗并准确检测其血浆浓度更具有癫痫治疗用药指导意义[11]。

本方法所设各检测成分的线性范围基本涵盖了药物的治疗窗，可满足临床药物监测的要求。

3.5流动相的选择
实验采用CH3CN-H2O(45︰55v/v)作为流动相，能使三组分完全分离，并能避免多数联用药物的干扰。

如果加大流动相中乙腈的比例，可使用出峰时间提前，但难以与联用药物分离而造成检测误差。

在此条件下完成一次图谱分析约需10min，一次检测从接收样本到发出报告可在一小时内完成。

如果患者联用药物可能对检测分析造成干扰，如艾司唑仑、氯硝西泮对内标物的干扰时，可选择地西泮作为内标进行实验，但完成一次检测分析需重新调整分析时间至20min，因为在此分析条件下，地西泮的出峰时间超过10min。

4结论
OXC近年来应用较多，临床使用效果理想。

采用本研究方法检测OXC活性代谢物MHD的血浆药物浓度，有利于大样本、常规检测，以便及时、准确地为临床治疗提供参考，为患者调整治疗方案，临床个体化用药提供依据。

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(本文文献格式：刘东平，谢海燕．RP-HPLC法测定血浆中奥卡西平及其活性代谢物浓度[J]．广东化工，2021，48(10)：231-233)
(上接第210页)
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(本文文献格式：李闫飞，柳文俊，王珏．顶空气相色谱-电子捕获检测器法测定原料药中痕量的卤代烷烃[J]．广东化工，2021，48(10)：209-210)。