不结球白菜分蘖性状的发生机理及其候选基因挖掘

不结球白菜分蘖性状的发生机理及其候选基因挖掘不结球白菜(Brassica rapa ssp. chinensis Makino)原产中国,是十字花科芸薹属中重要的蔬菜作物之一。

不结球白菜可以分为五大类,分别是:1.普通白菜munis (Tsen etLee) Hanelt, 2.塌菜 var. rosularis (TsenetLee)Hanelt, 3.菜薹 var.parfaachinensis (L.H. Bailey) Hanelt, 4.薹菜 var.tai-tsai Hort.,5.分蘖菜 var. multiceps Hort.。

其中分蘖菜表现为特殊的多头分枝特性,在营养生长阶段即有大量侧枝形成,状如分蘖,又叫多头菜。

本研究主要以分蘖菜品种’马耳头’和普通白菜品种’苏州青’为研究材料,对分蘖菜的多头分枝特性进行观察,解剖,测定内源激素含量变化,探讨其发生机理。

构建F2分离群体,利用高通量测序技术进行分蘖性状相关的候选基因的挖掘。

研究内容如下:1不结球白菜分藥性状的特点不结球白菜的多数品种在开花期会有大量侧枝从茎基部(一级分枝)及叶腋之间(二级分枝)抽出,一般在营养生长期无侧枝形成。

但不结球白菜变种之一的分蘖菜在营养生长阶段即有侧芽从短缩茎基部和成叶间的叶腋处长出,进一步伸长生长发育成为由多片小叶组成的分枝。

形态学观察表明,营养生长达到一定阶段(10-12片),不结球白菜分蘖菜中的侧芽开始
形成并长出,直到每一个叶腋处都有一个侧芽并最终长成分蘖,具有一片成叶对应一个分藥的特点。

组织切片观察显示,’苏州青’和’马耳头’都有腋分生组织的形成,但形成时期略有不同。

’苏州青’中腋分生组织形成后进入休眠状态而’马耳头’中腋分生组织形成后无休眠过程直接继续发育并进一步形成分藥。

生殖生长开始后,’苏州青’中的腋芽结束休眠也开始向外生长,形成侧枝后开花结果。

成株期部分营养品质含量测定结果显示,分蘖菜的硝态氮、可溶性蛋白和Vc含量都显著高于普通白菜。

2激素对不结球白菜分藥性状的影响利用酶联免疫反应法(ELISA)测定’马耳头’和’苏州青’内源激素含量结果显示:生长素主要参与了’苏州青’中侧芽的休眠,抑制侧芽向外生长,是’苏州青’中顶端优势现象起主要作用的激素;细胞分裂素在’马耳头’分蘖发生过程中起主要促进作用。

对’马耳头’的根部外施细胞分裂素(6-BA)和独脚金内酯(GR24),处理6天后发现,独脚金内酯抑制侧芽的发生和生长而细胞分裂素促进侧芽的发生和伸长。

Q-PCR结果显示,细胞分裂素响应基因BcRR4和BcRR5在’马耳头’中的增加量显著高于’苏州青’中的增加量,说明’马耳头’对细胞分裂素的响应更敏感;BcBRC1基因在’马耳头’中的表达量显著低于’苏州青’中的表达量,说明在“细胞分裂素-独脚金内酯调控茎分枝”这一抑制分蘖发生的调控途径中,’马耳头’响应机制劣于’苏州青’。

3两杂交组合6个遗传群体的数量遗传学分析利用分蘖亲本’马耳头’、’如皋毛菜’和不分蘖亲本’苏州青’构建遗传群体(P1、P2、F1、F2、BC1和BC2),对分蘖数和叶片数进行主基因+多基因的混合遗传模型分析。

结果显示不结球白菜分蘖数和叶片数均符合E-1混合遗传模型,受2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因控制。

分蘖性状不仅受两对主基因控制,也受更多微效多基因的遗传影响。

F2中主基因加多基因的遗传率达到61.58%～96.83%,说明分蘖数和叶片数主要由遗传因素控制,环境对分蘖数和叶片数的影响稳定而微效。

遗传率的高低
决定选择世代的早晚,高遗传率说明早期选择是有效的。

4利用F2群体进行BSA-简化基因组测序分析及SSR分子标记开发测定1000株F2群体的分蘖数,选取分蘖数分别为0、1-2、5-6、8-9和≥10各50株抽提DNA,形成五份DNA混池并利用限制性内切酶EcoRI+Mse I酶切后测序。

利用分布在全基因组的SNP标记对五种DNA池进行基因型鉴定,筛选在若干DNA混池之间存在多态性差异的标记(Marker),根据这些标记进一步确定与分蘖相关的候选区域,对区域内基因进行注释和q-PCR筛选,进一步确定用于做功能验证的基因。

根据简化基因组测序的结果进行与分蘖性状相关的分子标记的开发,得到9对SSR分子标记。

其中有8对能在亲本中扩增出较为清晰的条带,有效引物比例为90%,其中编号为Bra028643、Bra023312、Bra002958和Bra002957的基因对应的4对引物在亲本中表现出稳定的多态性,SSR标记引物开发成功率为50%。

5不结球白菜分蘖性状转录组学分析将’苏州青’和’马耳头’两个时期的根(R)、茎尖(SAM)和叶片(L)共计12个样本进行了无参转录组测序并组装成一套参考序列。

获得了总长为120,205,788 nt的119,237个Unigenes,其中得到注释的基因共计104,086 (87.29%)。

获得了32,065个SSR标记位点。

KEGG数据库注释得到3,768 (6.25%)个涉及到激素信号调控途径的基因。

将非分蘖期(Stage0)和分蘖期(Stage 1)样本中的基因进行差异性表达分析后发现,在两个种质之间及同一品种的不同组织部位之间存在巨大的差异性表达基因(DGEs)。

在’马耳头’的根、茎尖和叶片的DGEs中共统计得到分属于30个基因家族的612个转录因子。

组装的结果提供了一个覆盖范围比例相当大的转录组数据,可以用于与分蘖
相关的差异表达基因和功能基因定位的进一步分析。