双酶切及连接

限制性内切酶的类型

根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是 否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大 类。
限制性内切酶的类型

第一类（I型）限制性内切酶：能识别专一 的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地 方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺 序没有专一性，是随机的。这类限制性内 切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不 大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 这类酶如EcoB、EcoK等。
dna完全没有被内切酶切割原因对策内切酶活性下降内切酶稀释不正确dna不纯反应条件不佳内切酶识别的dna位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰部分dna溶液粘在管壁上内切酶溶液粘度大取样不准酶切后dna粘末端退火由于反应溶液温度强烈振荡使内切酶变性过度稀释使酶活性降低反应条件不适识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序用510倍量过量消化用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶同上同上反应前离心数秒将内切酶稀释增大取样体积电泳前将样品置65保温510分钟取出后置冰浴骤冷使用标准反应缓冲液及温度避免强烈振荡适当稀释酶液反应液稀释的酶不能贮藏使用最佳反应体系加大酶量510倍问题二
限制性内切酶的类型
第二类（III型）限制性内切酶：也有专一的
识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固 定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是 特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。 因此也不能应用于基因克隆。
限制性内切酶的类型





第三类（Ⅱ型）限制性内切酶：就是通常指的ＤＮＡ限制性 内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能 在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推 动了分子生物学的兴旺和发展。
3.
4. 5.
同上
同上 反应前离心数秒
6.
7.
将内切酶稀释，增大取样体积
电泳前将样品置65℃保温5-10分 钟，取出后置冰浴骤冷 使用标准反应缓冲液及温度，避 免强烈振荡 适当稀释酶液，反应液稀释的酶 不能贮藏
对 策
8.
9.
10. 11.
使用最佳反应体系
加大酶量5-10倍
5组：李东 老师：陈思
目录
• • • • • • • 原理 类型 命名法 实验 注意事项 连接 常见问题及对策
DNA的限制性酶切实验原理


核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定 碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中 发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于 抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯 键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
加体系离心 37℃ 水浴1h 跑电泳
结果
结果与分析
• 质粒的双酶切没有出现结果但marker出了 条带说明胶没有问题，而PCR的酶切产物 出现了较好的实验结果。
五、注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割 双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 切割后形成
5’…… GAT
内切酶失活
2.
DNA不纯，含有SDS，酚 ，EDTA等内切酶抑制因子
条件不适（试剂、温度） DNA酶切位点上的碱基被 甲基化 DNA酶切位点上没有甲基 化（如Dpn I）
3. 4.
对 策Biblioteka 5.5.6.
6.
7.
DNA位点上存在其它修饰
DNA不存在该酶识别顺序
7.
六、限制性内切酶酶切常见问题分析 问题二：DNA切割不完全
3’…… CTA
ATC …… 3’
TAG …… 5’
这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
限制性核酸内切酶的命名法
用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表 示，所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 (Heamophilus influenzae)Rd 菌株用d，即 Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
原 因
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
1. 2.
用5-10倍量过量消化 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
内切酶活性下降 内切酶稀释不正确 DNA不纯，反应条件不佳 内切酶识别的DNA位点上的碱 基被甲基化或存在其它修饰 部分DNA溶液粘在管壁上 内切酶溶液粘度大，取样不准 酶切后DNA粘末端退火 由于反应溶液、温度、强烈振 荡使内切酶变性 过度稀释使酶活性降低 反应条件不适 识别位点两侧插入了可影响酶 切效率的核酸顺序
实验材料及仪器
• 高速离心机，电炉，电泳仪，制胶槽，电 泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰 盒，枪头，Ep管，手套，记号笔，TAE电 泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)， 质粒DNA
双酶切
按如下体系加入到0.5ml离心管中 无菌水 10x缓冲液 质粒 Bgl I Sal II 共20μL 0.8μL 2μL 16μL 0.6μL 0.6μL
六、限制性内切酶酶切常见问题分析
问题一：DNA完全没有被内切酶切割
原 因
1.
1.
2. 3. 4.
标准底物检测酶活性
将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 检查反应系统是否最佳 换用对DNA甲基化不敏感的同裂 酶酶解，重新将质粒DNA转化至 dcm-，dam-基因型的细菌菌株 换用不同切割非甲基化位点的同裂 酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌 株中扩增 将DNA底物与λDAN混匀进行切 割验证 换用其它的酶切割DNA或过量酶 消化进行验证
连接反应
• DNA 分子的体外连接（重组）是指外源 DNA 片段和载体 DNA 分子在体外通过 DNA 连接酶共价连接。 • DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的 5'磷酸和3'羟基间可由联接酶催化形成磷酸 二酯键，即能完成联接反应。
连接体系
10× Buffer 载体 DNA T 4酶 无菌水 2.5μL 1μL 10μL 1μL 10.5μL 共25μL
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，
这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为 粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G 3’……CTTAA AATTC……3’ G……5’