大肠杆菌感受态的CaCl2制备方法及问题解答

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大肠杆菌感受态的CaCl
制备方法:
2
1.受体菌E.coil JM109活化,从-70℃冰箱中取出菌种,在LB培养基上划线,37℃
培养过夜。

2.挑取划线平板上的单菌落接种于3-5 mL LB液体培养基中,37℃摇床培养过
夜形成种子菌液。

3.取1mL种子菌液接于50 mL新鲜的LB液体培养基中,37℃摇床培养2-2.5 h
后,大约是对数生长期,取出,以LB液体培养基为空白对照,测菌液的OD 值,OD≈0.6时,停止培养,放置于4℃冰箱冷却半小时。

4.取对数生长期的菌液50 mL转移到无菌离心管中,置于冰上放10
min,4℃,6000rpm,离心10 min,在超净台内倒出上清液。

倒置1 min,使最后的痕量培养基流尽。

5.加入10 mL冰上预冷的0.1 M CaCl2重悬,打匀,置于冰上20 min.
6.4℃,6000rpm,离心10 min。

7.在超净台上倒出上清,并用灭菌滤纸条吸尽残夜。

8.加入405 uL冰上预冷的0.1 M CaCl2和95 uL 80%甘油,轻轻悬浮混匀,冰浴
3min.
9.按照每管40 uL分装感受态细胞,液氮速冻后放于-70℃冰箱保存。

常见问题解答:
1)转化实验为什么要先用液态的LB后用固态的培养基呢?
转化实验用液态的LB是为了让细胞恢复培养,也称之为让其孵育,质粒或其他经在液态LB中恢复培养后再涂布平板(固态培养基),是为了分散开,以培养
单克隆。

一般经37℃倒置培养12-16h后,就可以看到有单个克隆长出,就可挑
取了
2)大肠杆菌感受态细胞制备试验中为什么转化后要在37℃摇床上温育1h?
温育就是让感受态恢复一下状态,以及一些相关抗性基因的表达,毕竟从-80℃的
环境中取出,需要一段时间适应,然后方可转化。

(建议:国内的研究人员,喜欢做这一步,其实这步完全可以省略,直接涂平板,感受态没问题的话,作出的克隆够你用的了,10000个与1000个,对于你挑的平板来说一样的,关键是节省了时间,国内试验的时间资源太浪费,东西出的慢,这是个小trick,大家可以试一下)3)大肠杆菌感受态制备为什么要冰上操作,0-4℃操作?
细菌处于0℃,CaCl2 的低渗溶液中,菌细胞会膨胀成球形,转化混合物中的
DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面(因为DNase会消化
外源DNA,如形成抗DNase的物质有利外源DNA的生存),从低温突然提高
到42℃短时间热刺激,应激反应下可产生大量cAMP,而cAMP可改变细胞膜通
透性,促使细胞吸收DNA复合物,从而大大提高转化率。

4)为什么要采用对数生长期的菌?
用对数期细菌因为对数期细胞生长旺盛,新生细胞壁薄,细胞膜通透性好,外源
DNA容易进入,同时意味着各种DNA复制所需的酶在细胞内全数到位,当外
源DNA进入后有现成材料可以利用,迅速展开复制,重组等一系列过程,即这
种情况下,外源DNA更容易站稳脚跟,从而转化率也较高。

5)大肠杆菌感受态细胞转化实验中没冰浴就热击会怎样?
冰浴过程中,原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合,在低温下形成液晶结
构,这样,在42℃热激下,这种液晶结构收缩,将细胞膜扯开孔道,使DNA进入细菌细胞中。

冰浴是为了质粒附着在菌体表面;热击是打开通道让质粒进入。

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