大肠杆菌感受态的CaCl2制备方法及问题解答

大肠杆菌感受态的CaCl
制备方法:
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1.受体菌E.coil JM109活化，从-70℃冰箱中取出菌种，在LB培养基上划线，37℃
培养过夜。

2.挑取划线平板上的单菌落接种于3-5 mL LB液体培养基中，37℃摇床培养过
夜形成种子菌液。

3.取1mL种子菌液接于50 mL新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床培养2-2.5 h
后，大约是对数生长期，取出，以LB液体培养基为空白对照，测菌液的OD 值，OD≈0.6时，停止培养，放置于4℃冰箱冷却半小时。

4.取对数生长期的菌液50 mL转移到无菌离心管中，置于冰上放10
min,4℃,6000rpm,离心10 min,在超净台内倒出上清液。

倒置1 min,使最后的痕量培养基流尽。

5.加入10 mL冰上预冷的0.1 M CaCl2重悬，打匀，置于冰上20 min.
6.4℃,6000rpm,离心10 min。

7.在超净台上倒出上清，并用灭菌滤纸条吸尽残夜。

8.加入405 uL冰上预冷的0.1 M CaCl2和95 uL 80%甘油，轻轻悬浮混匀，冰浴
3min.
9.按照每管40 uL分装感受态细胞，液氮速冻后放于-70℃冰箱保存。

常见问题解答：
1）转化实验为什么要先用液态的LB后用固态的培养基呢?
转化实验用液态的LB是为了让细胞恢复培养，也称之为让其孵育，质粒或其他经在液态LB中恢复培养后再涂布平板（固态培养基），是为了分散开，以培养
单克隆。

一般经37℃倒置培养12-16h后，就可以看到有单个克隆长出，就可挑
取了
2）大肠杆菌感受态细胞制备试验中为什么转化后要在37℃摇床上温育1h？
温育就是让感受态恢复一下状态,以及一些相关抗性基因的表达，毕竟从-80℃的
环境中取出，需要一段时间适应，然后方可转化。

（建议：国内的研究人员，喜欢做这一步，其实这步完全可以省略，直接涂平板，感受态没问题的话，作出的克隆够你用的了，10000个与1000个，对于你挑的平板来说一样的，关键是节省了时间，国内试验的时间资源太浪费，东西出的慢，这是个小trick,大家可以试一下）3）大肠杆菌感受态制备为什么要冰上操作,0-4℃操作？
细菌处于0℃，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞会膨胀成球形，转化混合物中的
DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面（因为DNase会消化
外源DNA，如形成抗DNase的物质有利外源DNA的生存），从低温突然提高
到42℃短时间热刺激，应激反应下可产生大量cAMP，而cAMP可改变细胞膜通
透性，促使细胞吸收DNA复合物，从而大大提高转化率。

4）为什么要采用对数生长期的菌？
用对数期细菌因为对数期细胞生长旺盛，新生细胞壁薄，细胞膜通透性好，外源
DNA容易进入，同时意味着各种DNA复制所需的酶在细胞内全数到位，当外
源DNA进入后有现成材料可以利用，迅速展开复制，重组等一系列过程，即这
种情况下，外源DNA更容易站稳脚跟，从而转化率也较高。

5）大肠杆菌感受态细胞转化实验中没冰浴就热击会怎样？
冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结
构，这样，在42℃热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。

冰浴是为了质粒附着在菌体表面；热击是打开通道让质粒进入。