新陆早43号棉花父本花粉活力测定方法的比较

新陆早43号棉花父本花粉活力测定方法的比较
王刚;刘辉;吕新;余渝;赵海;樊庆鲁
【摘要】为了配合新陆早43号棉花在新疆石河子垦区的大面积制种,以确保满足
大田生产所需的用种量,从而使其在北疆地区大面积推广.以新陆早43号的父本为
研究对象,采用液体培养基花粉培养法、联苯胺-甲萘酚染色法、碘-碘化钾染色法、氯化三苯基四氮唑染色法4种方法测定新陆早43号父本的花粉活力.结果表明:4
种测定方法均能检测新陆早43号父本的花粉活力；但经过进一步的试验分析发现,碘-碘化钾染色法不适合作为棉花花粉活力的检测方法,同时氯化三苯基四氮唑染色法需在12h后方能正确检测棉花的花粉活力.得出结论:联苯胺-甲萘酚染色法为检
测新陆早43号父本花粉活力的简单、快速、准确的最佳方法.
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2013(041)002
【总页数】3页(P88-90)
【关键词】新陆早43号;花粉活力;测定方法
【作者】王刚;刘辉;吕新;余渝;赵海;樊庆鲁
【作者单位】新疆农垦科学院科技成果推广处,新疆石河子832000;新疆农垦科学
院科技成果推广处,新疆石河子832000;新疆石河子大学科技处,新疆石河子832000;新疆农垦科学院棉花研究所,新疆石河子832000;新疆石河子农科中心棉
花研究所,新疆石河子832000;新疆农垦科学院科技成果推广处,新疆石河子832000
【正文语种】中文
【中图分类】S562.035.2
新陆早43号棉花属于杂交棉品种，它在各个方面的优异表现主要依靠的是双亲杂交的超亲优势，新陆早43号主要选择品种间相互亲和性程度高且花粉生活力强的品种作为父本，在授粉过程中不但要注意母本的去雄质量，而且对花粉的生活力状况也应加以注意。

在植物育种过程中，父本花粉的产量及其质量直接影响到育种的成败，因此花粉生活力的测定方法及测定标准一直是育种家关注的问题[1]。

在杂交组合的配置研究中，授粉前准确、快速地测定花粉生活力具有重要的意义。

本试验通过采用植物花粉活力测定的液体营养基花粉培养法、联苯胺-甲萘酚染色法、碘-碘化钾(I2-KI)染色法和氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法4种不同的检测方法对花粉活力进行检测分析，以筛选出能快速、准确测定花粉生活力的检测方法。

1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为新陆早43号父本4-14品系，种植于石河子市农业科技开发研究中心的棉花育种基地，试验地点在育种基地的分子育种试验室。

1.2 试验方法
1.2.1 花粉的采收及试验设计选择天气晴朗、气温在 25～30 ℃ 之间、相对湿度不大的7月10日、7月15日、7月18日的9：30—10：30采集新陆早43号父本当天开放的花朵，采用液体培养基花粉培养法、联苯胺-甲萘酚染色法、I2-KI 染色法和TTC染色法4种方法测定父本花粉的生活力。

观察不同测定方法下花粉生活力的差异，以筛选出快捷、方便测定花粉生活力的方法。

7月10日采集的花粉在室温[(25±1) ℃]下放置1、6、12、24、48 h后，再用4
种不同的检测方法观察测定父本花粉的生活力，观察不同测定方法间的差异，以筛选出较为准确的花粉测定方法。

1.2.2 花粉生活力的测定液体培养基花粉培养法：培养基配方为0.35 mol/L蔗糖、0.03% CaCl2、0.01% H3BO3、0.7%琼脂，培养温度26～28 ℃。

在载玻片上滴
2滴培养液，撒上少量花粉，加上盖玻片，放在预先备好的放有少量加水卫生纸的培养皿中，培养2～3 h，在显微镜下即可观察到花粉管的萌芽和伸长情况，顺着
一个方向记数，计算百分数[2]。

联苯胺-甲萘酚染色法：称取0.2 g联苯胺溶于100 mL 50%乙醇中，盛于棕色瓶内；称取0.15 g甲萘酚溶于100 mL 50%乙醇中(先用极少量95%乙醇溶成浆糊
状之后再加入50%乙醇进一步溶解)，盛于棕色瓶内；称取0.25 g碳酸钠溶于
100 mL 蒸馏水中。

以上3种溶液在试验时以等体积混合、摇匀后使用。

取花粉粒涂于载玻片上，先加1～2滴联苯胺-甲萘酚试剂，再加1滴3% H2O2，3～5
min后在显微镜下，每个载玻染色片取5个视野进行观察记数。

I2-KI染色法：将3 g碘化钾溶于蒸馏水中，再加入1 g碘，然后定容至100 mL。

取尚未开裂的花药于干洁的载玻片上，滴加1滴I2-KI溶液。

用解剖针将花药壁撕裂，充分释放出花粉粒后用盖玻片盖上，待观察[3]。

TTC 染色法：用针剥离花粉，使其散落在载玻片上，加入适量1% TTC 溶液(用
pH值7.2的2 mol/L磷酸缓冲液配制)，用镊子轻轻搅荡使花粉粒均匀散开，然
后轻轻盖上盖玻片，在35 ℃下放置10～15 min。

被染成红色的花粉，其活力较强，淡红色次之，无色的为不具活力的花粉或不育花粉[4]。

1.2.3 数据统计分析所有试验均重复3次，各处理每次统计200个以上的花粉粒，计算花粉萌发率和有活力花粉的百分数。

将调查的花粉活力数据用Excel 2003进行整理、制表和绘图。

用统计分析软件对数据做方差分析[5]。

2 结果与分析
2.1 新鲜花粉生活力不同测定方法的比较
表1的结果表明：液体培养基花粉培养法、联苯胺-甲萘酚染色法、I2-KI染色法、TTC 染色法等4种方法均能测定新陆早43号的花粉活力。

其中用液体培养基花粉培养法、联苯胺-甲萘酚染色法、I2-KI染色法3种方法测定花粉生活力显示，新
陆早43号父本的花粉生活力差异不明显，这3种测定方法与TTC 染色法的测定
值有一定的差异。

但这4种测定方法所得出有活力花粉的测定值经方差分析后表
现出差异显著性。

采用I2-KI染色法测定的结果，均为显著偏高，TTC染色法的测定值均为显著偏低，因此I2-KI染色法和TTC染色法都不能确定为最适宜新陆早
43号花粉生活力的测定方法，还须继续进行更多的试验分析。

在比较中发现，联
苯胺-甲萘酚染色法的测定值介于I2-KI染色法和液体培养基花粉培养法之间，且
与液体培养基花粉培养法在0.01水平上差异不显著。

试验过程中液体培养基花粉
培养法的准备工作较多，步骤较为繁琐，耗时耗力，因此联苯胺-甲萘酚染色法与
液体培养基花粉培养法相比，更能快捷、方便地测定新陆早43号父本花粉的生活力。

表1 新鲜花粉生活力不同测定方法的比较结果测定日期花粉生活力(%)液体培养基花粉培养法联苯胺-甲萘酚染色法I2-KI染色法TTC 染色法7月10日
85.6592.3795.1976.157月15日 85.1288.5592.6473.157月18日
86.389.694.4770.26平均85.69aA90.17bAB94.1cB73.19dC
注：同行数据后不同大、小写字母分别表示差异极显著(P<0.01)、显著(P<0.05)。

2.2 室温[(25±1) ℃]下放置不同时间段后花粉生活力的变化
2.2.1 液体培养基花粉培养法新陆早43号父本的花粉萌发率随培养时间的推移均
呈下降趋势。

花粉萌发率在1～6 h内都在80%以上，以后逐渐缓慢下降；24 h
后下降趋势加快；在48 h时的萌发率为65.75%(图1)。

2.2.2 联苯胺-甲萘酚染色法新陆早43号父本的花粉萌发率随培养时间的推移均呈快速下降趋势。

花粉萌发率在 1 h 内都在90%以上，但在6 h时下降到70%，6～12 h时下降趋势放缓，随后下降趋势加快，在48 h时的萌发率只有30%左右(图2)。

2.2.3 I2-KI法利用I2-KI染色法测定新陆早43号父本花粉的活力，在室温条件下放置1、6、12、24、48 h后测得染色率分别为95.19%、92.16%、9
3.55%、91.19%、92.49%，染色率不随时间的延长发生变化，染色率的值均保持在91%～95%之间，波动不大。

2.2.4 TTC染色法用TTC染色法测定新陆早43号父本花粉活力，在染色时间1～6 h之间，TTC染色率保持在75%以上，呈微缓上升的趋势；在6～12 h间，TTC的染色率快速上升到86.61%，随后随时间的增加染色率呈现下降趋势，48 h 时TTC染色率为50%。

整个变化曲线在染色1～12 h内为上升趋势，在 12 h 时达到峰值，随后呈下降趋势。

因此在用TTC染色法测定棉花花粉活力时，将测试材料放置12 h左右后得出的结果较为准确(图3)。

3 结论与讨论
根据花粉经过联苯胺-甲萘酚染色法、I2-KI染色法、TTC 染色法进行染色后的反应来检验其活力，都是对花粉活力进行的间接检验，只有在这些检验方法的结果与萌发检验、授粉检验的结果相一致或呈显著相关的前提下，才可以应用这些方法。

液体培养基花粉培养法、联苯胺-甲萘酚染色法、I2-KI染色法、TTC染色法等4种方法均能测定新陆早43号父本的花粉活力。

但经过进一步试验分析发现，I2-KI 染色法不适合作为棉花花粉活力的检测方法，同时TTC染色法须在12 h后方能正确检测棉花花粉的活力。

试验中联苯胺-甲萘酚染色法和液体培养基花粉培养法的
测定结果较为一致，并已经经过多次试验证明，其效果趋势稳定，相比之下这2
种方法中的联苯胺-甲萘酚染色法简单、迅速，虽然不能直接表现花粉的萌发率，
但与液体培养基花粉培养法的结果相似，联苯胺-甲萘酚染色法可确定为检测新陆
早43号父本花粉活力的简单、快速、准确的最佳方法。

在采用I2-KI染色法检测花粉活力的过程中，检测出的染色率不随时间的延长发生变化，染色率的值均保持在 91%～95% 之间，且波动不大。

分析产生这一结果的原因，可能是I2-KI染色法主要是靠花粉粒内的淀粉而进行染色的，其着色程度由花粉壁的薄厚和花粉内支链淀粉和直链淀粉比例的高低决定。

新陆早43号父本有活力的花粉粒中积累较多的淀粉，I2-KI溶液可将其染成蓝色，而活性很弱的花粉
和失活的花粉往往也含有淀粉或积累较少淀粉，遇碘时同样呈蓝色反应，故I2-KI
染色法在对花粉进行染色的过程中染色率保持不变，因而I2-KI染色法不适用于作为新陆早43号父本花粉活力的测定方法。

在采用TTC染色法检测时，发现测试材料在放置12 h后的观察测试值最高，产生这种结果的原因之一可能是受花粉自身特性(如花粉壁的厚薄、花粉外壁的组成物质、花粉内各种酶活性的强弱等)的影响，原因之二可能是受外界环境(如溶液的配置、温度、湿度等)的影响[6]。

液体培养基花粉培养法是测定新陆早43号父本花粉活力较为准确和有效的方法，在试验中已得到证实。

综合前人在花卉、林木方面的研究结果，液体培养基花粉培养法作为测定花粉活力的有效方法已经是公认的。

因为花粉萌发率表征了花粉的潜在活力，花粉只有萌发并长出花粉管，才能在适宜的花丝上伸长并直达花丝基部的子房，从而完成受精过程[7]。

但此法须要事先配制培养基，且需要在特定温度和较长培养时
间下才能实现，同时为了所测结果的准确性需要一定的重复次数，操作十分繁琐。

因此，当需要在授粉前对花粉生活力进行快速测定时，液体培养基花粉培养法的应用有一定的局限性。

本试验的培养条件是否为最适条件还有待进一步研究。

总体上来看，染色法简单、迅速，能够在一定程度上直接反映花粉的代谢情况或营
养含量，但受花粉自身特性的影响大，不能直接表现花粉的萌发率[8]。

因此不同的染色法适合特定植物花粉生活力的测定还有待考证。

液体培养基花粉培养法可以直接区分死亡或缺乏活力的花粉，数据可靠，但须要依据不同的植物配制不同的培养基，并在适宜的温度、湿度等培养条件下测定其生活力，耗时相对较长[9]。

田间授粉测定法准确但速度太慢，而且还受到田间气候、环境条件及母本植株性状的影响，测定结果明显低于染色法。

本试验还须继续改进和完善，如在记录花粉收集情况和试验过程中需要更加具体的数据，如湿度、气压、检测仪器的精确化程度等方面；液体培养法和染色法分别根据花粉粒的萌发和染色反应来检验其生活力，两者都是对花粉生活力进行的间接检验，并非直接表现花粉在田间的实际萌发率，只有在这些检验方法得到的数据与授粉检验相一致或呈相关性的情况下，才适合将它们在棉花花粉活力检测方面进行广泛应用。

笔者所进行的检测花粉生活力的试验研究，尚有许多不完善之处，有待于进一步研究与探讨。

参考文献:
【相关文献】
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