林蛙皮、卵活性成分提取方法及药理作用的研究进展

林蛙皮、卵活性成分提取方法及药理作用的研究进展
刘洋;赵鹤鹏;张扬
【摘要】林蛙皮、卵中含有多种对人体有益的活性成分,对其深入研究有利于林蛙资源的综合利用.本文对林蛙皮、卵的主要活性成分提取方法及药理作用进行综述,
为其在药品、保健品、化妆品等大健康领域的开发利用提供参考.
【期刊名称】《吉林化工学院学报》
【年(卷),期】2019(036)001
【总页数】6页(P15-20)
【关键词】林蛙皮;林蛙卵;活性成分;提取方法;药理作用
【作者】刘洋;赵鹤鹏;张扬
【作者单位】吉林化工学院化学与制药工程学院,吉林吉林132022;吉林化工学院党政办公室,吉林吉林132022;吉林化工学院化学与制药工程学院,吉林吉林132022
【正文语种】中文
【中图分类】R931.6
中国林蛙(Rana chensinensis)又称哈士蟆，主要生长在我国吉林、辽宁和黑龙江
三省，现已形成规模化养殖，是一种集食药用于一身的经济蛙种[1,2].林蛙油是雌
性林蛙的干燥输卵管，具有补肾益精、养阴润肺等功效，是一种补益类传统中药材，1985年收录中国药典至今[3].由于林蛙油市场价格昂贵，多数养殖户是为了获取
林蛙油，在取油同时，多数林蛙皮和卵作为废物白白丢弃.近年来，研究人员发现林蛙皮、卵同样富含多种活性成分，具有广泛的药理作用，这引起了广泛关注，对其研究也逐渐深入.本文综述了林蛙皮和卵的主要成分和药理作用，为进一步开发提供参考.
1 活性成分提取方法
1.1 蛋白
郑淼等[4]利用羟脯氨酸法提取林蛙皮中胶原蛋白，在温度37 ℃，胃蛋白酶30 mg条件下浸提72 h后，经盐析、透析和真空冷冻干燥，得林蛙皮胶原蛋白，收率15%，蛋白含量54.1%.吕玲玲等[5]利用木瓜蛋白酶提取林蛙皮中胶原蛋白，在pH 5.5，料液比120，加酶量1%，室温条件下浸提36 h，林蛙皮胶原蛋白提取率为 24.71%，纯度72.03%.相比于羟脯氨酸法，木瓜蛋白酶辅助提取法的得率和纯度都有所提高，可作为林蛙皮胶原蛋白的制备方法.
李永政等[6]对东北林蛙卵蛋白的酶解工艺和抗疲劳活性进行了研究.结果表明，在pH 8.0，温度55 ℃，料液比 15.5(m/V)，加酶量3 000 U/g条件下提取5 h，所得粗产品中蛋白质的含量为80.07%.在抗疲劳试验中，林蛙卵酶解物可显著延长小鼠负重游泳时间、降低血乳酸含量，显示良好的抗疲劳作用.季晓枫等[7]应用响应面法优化酶法制备林蛙卵蛋白.研究表明，在pH 8.8，温度58 ℃，料液比15，加酶量1.9%的条件下浸提4 h，林蛙卵蛋白提取率为9.63%.陶凤云等[8]对林蛙卵蛋白进行分离纯化，得到一种具有选择性细胞毒性的小分子核糖核酸酶，为肿瘤的治疗提供了新的候选蛋白分子.
1.2 多糖
Wang等[9]采用响应面法优化提取林蛙皮多糖，在温度100 ℃，料液比160，提取时间4.96 h，多糖得率2.03 0.14%，经分离纯化得到RCSP Ⅱ，该组分具有较强的体外抗氧化活性.酶辅助提取是是制备天然多糖的重要手段之一，赵玉红等[10]
应用超声波-双酶法提取林蛙皮多糖，在料液比140(g/mL)，功率600 W条件下
提取25 min，多糖得率1.18%.在此基础上，在pH 9.0，温度45 ℃，碱性蛋白
酶添加量2.3%，胰蛋白酶添加量2.8%条件下酶解4 h，多糖得率升至2.286%.陈大勇等[11]应用木瓜蛋白酶从林蛙卵中提取多糖，并对其抗氧化活性进行研究.在pH 6.0，料液比120(g/mL)，酶添加量70 mg/g的条件下浸提2.5 h，林蛙卵多糖提取率2.67%，该条件下得出的林蛙卵多糖对DPPH自由基的半数清除率为
1.81 mg/mL，说明其具有明显的抗氧化作用.
1.3 生物活性肽
生物活性肽是一类分子量小于6 000 Da，且具有特殊生理和生化功能的肽类化合
物[12].许多来自两栖动物皮肤的抗菌肽已被分离、纯化并进行了结构表征，为新
型药物的研究提供了思路.林蛙皮肤分泌物中含有大量的生物活性肽，Zhang等[13]从林蛙皮中分别得到了酸法提取物(ARPs)和酶法提取物(ERPs)，通过UV、
FT-IR、HGLC、MS、MTS和流式细胞技术等方法对两者的理化性质进行了鉴定，并对其促增殖和抗凋亡作用进行了研究.结果表明，ARPs和ERPs的提取率分别为
0.65%和0.52%；ARPs(1.6 g/L)和ERPs(0.8 g/L)抗HACAT细胞的增殖率分别为
1.6倍(P<0.001)和
2.1倍(P<0.001)；在UVB刺激下，细胞凋亡率分别下降2.6
倍(P<0.001)和3.4倍 (P<0.001).杨闯等[14]比较了甲醇提取法、超声波辅助酶解法和超声波提取法制备林蛙皮生物活性肽，并对其抗菌活性进行研究.结果表明，
超声波辅助酶解法提取效果较好，在加酶量为1.5 mg/g，温度40 ℃，提取时间
4 h，提取率7.51%，且抗菌活性较高.Shang等[15]对来自林蛙皮肤分泌物的一种富含精氨酸/组氨酸的抗菌肽-香豆素缀合物进行了制备和的抗菌活性研究.结果表明，该缀合物具有选择性的抗菌作用，对革兰氏阳性菌有抑制作用，对阴性菌活性较差，安全性较高，对人红细胞无溶血作用.在此基础上，Shang等[16]研探索了
林蛙蛋白肽的抗菌构效关系，发现：用5～6个赖氨酸取代α-螺旋亲水表面的中
性和非极性氨基酸残基，提高其抗菌活性；用D-赖氨酸代替L-赖氨酸时，在保持净电荷和平均疏水性值的同时，对其抗菌活性影响较小，但能显著降低溶血活性. 1.4 透明质酸
透明质酸是一种酸性粘多糖，对维持机体水分、保持皮肤水分有良好的效果.袁海
恋等[17]利用Box-Benhnken中心组合设计原理和响应面分析法优化双酶水解法
制备林蛙皮透明质酸的方法，在温度为50 ℃，加酶量55 000 U/g的条件下酶解14 h，透明质酸平均提取得率达27.683 9 mg/g.
1.5 林蛙卵油
林蛙卵油能抑制自由基的产生，降低高脂血症血清胆固醇的含量和过氧化脂质含量，能够有效预防心血管疾病[18].金莉莉等[19]将林蛙卵经石油醚和超临界CO2流体
萃取制备林蛙卵油，并分析其中脂肪酸成分，研究表明，林蛙卵油中主要富含十六碳烯酸、亚油酸、油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等.赵超等[20]应用微波
辅助法提取林蛙卵油.将林蛙卵浸泡3.33 h后，在料液比19.82(g/mL)，微波功率600 W条件下微波30 min，提取率为20±0.67%.
1.6 氨基酸
李妍妍等[1]采用高效液相色谱法测定了林蛙皮、卵中氨基酸的种类与含量见表1.
结果表明，林蛙皮中氨基酸总量高于林蛙卵，但林蛙卵中必需氨基酸含量高于林蛙皮.
表1 林蛙皮、卵氨基酸含量(单位:g/100 g，色氨酸单位:mg/100 g)氨基酸AspThr∗SerGluProGlyAlaCysVal∗Met∗ Ile∗林蛙皮
6.473.024.2810.395.9210.946.301.622.691.38 2.31林蛙卵 5.563.724.68
7.92 1.732.042.381.122.441.393.47氨基酸Leu∗TyrPhe∗His Lys∗ArgTrp∗氨基酸总量必需氨基酸量林蛙皮4.942.222.61 1.404.035.0430.4 75.5921.01林蛙卵
5.093.432.16 2.153.563.5287.2 5
6.4521.92
2 药理作用
2.1 蛋白
林蛙卵蛋白具有抗疲劳和调节免疫的作用.张肃[21]等对东北林蛙卵蛋白的抗疲劳
活性进行了研究.结果表明，东北林蛙卵蛋白对小鼠体重增长无显著影响，可降低
运动后小鼠血乳酸含量，增加小鼠负重游泳时间及肝糖原含量.这表明，东北林蛙
卵蛋白具有增加小鼠抗疲劳的活性作用.李永政[22]等分别口服给予小鼠林蛙卵蛋
白和其酶解物，测定小鼠的负重游泳时间、肝糖原及血乳酸含量.结果表明，两者
均能显著延长小鼠负重游泳时间，增加肝糖原含量，且酶解物在延缓疲劳和加速消除疲劳方面作用效果更明显，这说明，林蛙卵蛋白及其酶解物均有明显的抗疲劳功效，且酶解物作用更强.
Shen等[23]研究了中国林蛙在冬眠前输卵管中c-kit受体的免疫反应，从林蛙卵
中提取总蛋白进行Westernblotting分析.结果表明，在冬眠前期林蛙卵组织中检测到c-kit受体和PCNA的阳性信号，这说明c-kit受体可能在林蛙卵中起到免疫调节作用.
2.2 多糖
多糖提取物具有不同程度的清除超氧阴离子、羟基自由基和DPPH自由基的能力，由此判断林蛙皮具有一定的抗氧化功效[24].Wang等[25]对从中国林蛙皮中分离得到的多糖组分RCSPⅡ进行了表征及体内外抗氧化活性研究.结果表明，RCSPⅡ由
葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成，摩尔比为87.822.771.54，分子量为12.8 kDa.体
外抗氧化活性测定表明，在2.5 g/L的浓度下，RCSPⅡ对DPPH自由基的清除率为75.2%；在4.0 g/L时，对亚铁离子的鳌和率为85.1%.体内抗氧化结果进一步
表明，RCSPⅡ能提高抗氧化酶的活性，降低丙二醛的含量，提高D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠肝脏和血清的抗氧化能力.
2.3 生物活性肽
生物活性肽具有一定程度的抗肿瘤，调节免疫和促进细胞增值作用.Temporin-
1CEa是从林蛙皮分泌物中分离得到的一种抗菌肽，Wang等[26]采用MTT法、
电镜观察、荧光染色和流式细胞术分析研究了Timein-1CEa对人乳腺癌细胞株Bcap-37的细胞毒性.MTT分析表明，Timein-1CEa暴露1 h可导致细胞迅速死亡，但对其是否存在浓度依赖有待进一步研究.电镜观察提示，Timein-1CEa暴露可导致Bcap-37细胞发生显著的形态学改变.荧光成像和流式细胞仪分析表明，Timein-1CEa具有以诱导细胞表面磷脂酰丝氨酸暴露为特征的膜破坏特性、质膜
透性和快速跨膜电位去极化.这表明，Timein-1CEa通过膜破坏和线粒体参与的胞内机制，在Bcap-37细胞中触发了快速的细胞毒性.该发现有利于进一步研究抗菌肽在哺乳动物癌细胞中的作用机制.Wang等[27]进一步探讨了Timein-1CEa对两种人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7的快速细胞毒作用机制.结果表明，Timein-1CEa暴露1 h，可导致细胞毒性，并与剂量成依赖性.电镜形态学观察表明，Timein-1CEa暴露1 h后，MDA-MB-231和MCF-7细胞均发生了明显的形态学改变.Timein-1CEa的膜破坏特性进一步表现为磷脂酰丝氨酸在细胞表面的暴露，提高质膜透性和快速去极化跨膜电位.此外，Timein-1CEa还可诱发细胞内钙离子和活性氧升高以及线粒体膜电位的紊乱.这说明，Timein-1CEa可快速引发乳
腺癌细胞死亡，这种快速的细胞毒作用可能是由膜破坏和细胞内钙机制共同介导的. 巢警殳[28]等研究了林蛙皮活性肽对小鼠免疫功能的影响，将小鼠随机分为阳性对照组、空白对照组和低、中、高剂量组.结果表明，林蛙皮生物活性肽可明显促进Con A 诱导的淋巴细胞增值，增加抗体生成细胞数量，增强血清溶血素抗体效价
水平，这说明林蛙蛙皮生物活性肽对小鼠的细胞免疫和体液免疫功能均具有增强作用.李俊峰[29]等研究发现，林蛙卵中含有的孕酮和雌二醇也具有调节人体内分泌，促进身体的生长发育的功能.
张鑫等[30]研究了林蛙皮多肽对HaCaT 细胞增殖及其凋亡的影响.结果显示，在
50 mg/mL～800 mg/mL浓度范围内，随着浓度升高，林蛙皮多肽对HaCaT细胞增殖作用效果增强；当浓度为800 mg/mL时，细胞凋亡率比正常对照细胞降低了(2.7±0.3)%(P<0.01)，说明林蛙皮活性多肽对HaCaT细胞的增殖有显著的促进作用，并对其凋亡有显著的抑制作用.Zhang等[31]制备了含有林蛙皮肽(RCSPs)的聚L-丙交酯(PLLA)/醇溶蛋白(Zein)纳米纤维垫.在电纺纳米纤维中加入RCSPs
能显著改善材料的力学性能.人包皮成纤维细胞的细胞通透性实验结果表明，PLLA/Zein-RCSPs纳米纤维垫的细胞生长明显高于PLLA/Zein纳米纤维垫.结果表明，含RCSPs的纳米纤维垫有望成为创面敷料的候选材料.
2.4 林蛙卵油
彭飞[32]等采用离子对反相液相色谱-电化学检测法，以士的宁为致惊厥剂，评价林蛙卵油抗惊厥活性的时效和量效关系.结果显示，在灌胃给药30 min时其抗惊厥作用效果最好，且效果与剂量成良好的线性关系.佟岩[33]等对林蛙卵油的抗焦虑活性进行了研究.结果表明，林蛙卵油能显著延长大鼠在十字迷路开放通路中的连续停留时间，增加大鼠进入开放通路次数，而对封闭通路连续停留时间和进入封闭通路次数无明显影响，小鼠站立数明显减少而爬梯数无显著差异.
苑春莉等[34]探究林蛙卵油对成年大鼠妇科内分泌激素水平的影响.结果显示，模型组子宫及卵巢重量明显低于正常组(P<0.001)，而林蛙卵油各剂量均可明显增加子宫及卵巢的重量(P<0.001)，高剂量组增加的最为明显；模型组卵巢体重比明显低于正常组(P<0.001)，而林蛙卵油各剂量均可明显增加卵巢体重比(P<0.001)，高剂量组增加的最为明显.这说明林蛙卵油可以发挥保护卵巢的作用，进而调节妇科内分泌功能.
尹云厚等[35]探究了东北林蛙卵油脂肪酸的体外抗氧化作用和保湿作用.抗氧化试验结果表明林蛙卵油脂肪酸对DPPH自由基清除作用的IC50为5.08 mg/m L，最大清除率为95.91%，对ABTS+自由基清除作用的IC50为9.84 mg/mL，最大
清除率为98.58，;对羟自由基清除作用的IC50为7.87 mg/mL.其还原力也随着林蛙卵油脂肪酸的溶液浓度的增加而增加.保湿性试验结果为0～12 h，林蛙卵油脂肪酸保湿性极显著低于透明质酸、甘油和1，2-丙二醇,而24 h时,其保湿性与甘油和1，2-丙二醇差异不显著，说明东北林蛙卵油脂肪酸具有持久的保湿效果.根据这两个性能，可以进一步将其应用到抗氧化和保湿型化妆品当中.沈雪等[36]研究表明林蛙油口服液在D-半乳糖诱导的氧化损伤模型小鼠体内具有良好的抗氧化的作用.
2.5 核糖核酸酶
林蛙卵核糖核酸酶具有抗肿瘤功效.赵丹玉等[37]从林蛙卵中提取RNase,并用酶谱分析进行鉴定，结果表明，林蛙蛙卵RNase对鼠S180肿瘤细胞株生长和淋巴细胞转化具有较强的抑制作用，并随着林蛙卵RNase浓度的增加，对S180肿瘤细胞生长率和淋巴细胞转化率的抑制作用随之增加，呈现剂量依赖性.说明林蛙卵RNase对S180肿瘤细胞的生长率和淋巴细胞转化率具有明显的抑制作用.
2.6 黑色素
吴世玉等[38]对林蛙卵黑色素的抗氧化活性实验表示.林蛙卵黑色素在紫外区域都有强烈的吸收，并且伴随波长的逐渐增加，吸光度呈现下降的趋势；元素分析表明林蛙卵黑色素的S∶N为0.05；红外光谱表明林蛙卵黑色素含有OH、NH2、
C=C、C=N、C=O、C-N和苯环.体外抗氧化试验表明林蛙卵黑色素对DPPH自由基的IC50为0.404 mg/mL，对超氧阴离子的IC50为1.250 mg/mL，对羟自由基的IC50为0.662 mg/mL，这说明林蛙卵黑色素是真黑色素,并且具有较强的抗氧化活性.
3 结论
林蛙作为集食用药用为一身的经济动物，在我国已经显现出越来越大的价值.东北地区林蛙产量逐年递增，除了林蛙油外，林蛙皮、卵等同样具有很高的营养价值，
然而由于深入开发不够，大多被白白浪费掉，不能发挥其最大价值.相信在不久的将来，随着对林蛙全身活性成分的深入探究，林蛙皮、卵的价值会被充分的利用，相信二者的同样具有巨大的开发前景.
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