液相色谱柱知识

高效液相色谱仪使用中常见问题及对策
高效液相色谱（HPLC）作为一种分离技术和方法，目前已经发展到一个全新的阶段。

高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据
处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。

液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于医药卫生、环境
监测、食品检测等领域。

作者本人从事液相色谱分析工作二十多年，应用HPLC技术在血药浓度、生物胺、核苷酸、蛋白质浓度测定等实际工作中，积累了许多的方法和经验，在这
里与大家交流，希望能对同行们有所帮助和借鉴，共同促进液相色谱分析技术的发展。

1高效液相色谱仪的基本工作原理
高效液相色谱仪如图1所示，是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。

高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。

样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。

柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一
被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]。

液相色谱仪是依靠色谱柱进行分离的。

研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相（液相和固相）中分配“平衡”的过程。

液相色谱是以具有吸附性质的硅胶
颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。

当液体样品在载体流动相的推动下，在液-固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数（K）不同，则使各自的移动速度不同，
即产生差速迁移。

各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。

上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中，由于在两相中浓度的不同，而存在分配系数上的差异。

既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因，那么，必然地也会同色谱理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系，事实上，色谱理论中通常用容量因子k
’的概念来反映物质在两相中的分配关系：
k’值可以非常方便地表达组分在两相的分配，又很容易从色谱实验数据中直接测得，是色谱理论中重要的基本参数之一[2]。

2输液泵的常见故障及对策
输液泵/高压泵是保证HPLC系统流路畅通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件，目前多用往复式恒流柱塞泵，主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成，用马达带动凸轮
驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。

常分为单柱塞泵、并联柱塞泵、串联柱塞泵和柱塞隔膜泵等类型。

流动相混合方式分为低压混合和高压混合。

常见泵的故障主要有以下几种
，并提供解决的办法。

2．1单向阀故障由于球与阀座密封不严，液体倒流，造成压力不稳，甚至球与阀座粘在一起阻死。

密封不严主要是污染或气泡引起，球与阀座粘连也是由于污染和磨损造成。

为避免单向阀中的宝石球和阀座被污染，流动相应使用HPLC级的溶剂，并且配好的流动相一定要用0．45u滤膜过滤和脱气。

如果泵被微粒污染，可分别用水、甲醇、异丙醇、
二氯甲烷依次冲洗。

冲洗时应打开泄液阀，最后再用所用的溶液冲洗整个系统。

气泡进入阀中会紧贴在阀体的一侧，使宝石球难返回到阀座，引起倒流，泵的压力和流速会明显改变。

此时，应立即打开泄液阀，大流量（2ml/min）冲洗泵，直至排除液为
直线型。

因为甲醇可润湿泵内壁，挤出气泡，故也可使用脱过气的甲醇冲洗泵。

长期不用的泵或新装的泵头应该用甲醇赶气泡。

泵进气泡也可在泵头上排气泡，即用扳手固定住进
气泡的泵头，拧开输出管道的压帽，手动泵送液，可见到气泡从孔中挤压出来，直至无气泡排出将压帽拧紧[3]。

采取上述办法仍不能使压力稳定，应考虑是否密封垫坏了？或单向阀磨损、球不光滑等，需更换部件。

2．2泵垫圈故障泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统。

液相色谱系统一般情况下不要使用强酸强碱溶液，因为这会损坏密封垫和柱塞杆。

密封垫圈与运动着的柱塞杆
紧密接触，可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来，它是液相色谱系统中最易磨损的部件。

有条件的实验室可三个月更换一次垫圈，防止泵系统污染。

如果用缓冲盐作流动相
则更会加速垫圈的磨损，应及时冲洗。

当垫圈损坏时，表现为：泵压力不稳、泵头漏液。

一旦出现这个现象，应尽快更换新垫圈。

为避免上述故障的发生，我们在分析工作中应注意以下几点：
①使用超纯水（18MΩ．cm）、纯度级别较高的试剂和色谱级溶剂配制流动相；
②配好的流动相一定要抽滤脱气，即便仪器有在线脱气装置，也最好在上机前进行抽滤。

真空抽滤既过滤颗粒也脱了气泡，非常有效。

③泵在起动前一定要通过泄液阀抽净泵里的空气。

④用缓冲盐洗脱时，分析结束后一定要用水冲洗泵和整个流路系统，不要让腐蚀性溶液滞留泵中，最后用有机溶剂充满系统。

3色谱分离柱的使用与维护
在前述仪器工作原理部分，我们已经指出，液相色谱仪的分离是在色谱分离柱中实现的。

我们目前工作中多采用反相色谱柱，如何保护好分离柱减少柱的污染是延长柱寿命的
关键。

3．1怎样维护好色谱分离柱
加保护柱（预柱）是保护分离柱的有效办法。

保护柱是根内装填料与分离柱性质相近的短柱，接在分离柱之前，或代替流路过滤器。

保护柱的作用是收集和阻塞分离柱口的化
学垃圾，这些垃圾如果直接进入分离柱会逐渐堆积在柱头，最终降低柱效能。

保护柱是消耗品，如分析血浆样品，一般分析50个样品后需更换新柱芯。

避免高压冲击分离柱。

一般色谱柱都能承受得起高压，但经不住突然变化的高压冲击，
这将改变柱床体积，影响柱效。

引起高压冲击的原因主要有：进样器的样品阀的缓慢转
动、泵启动太快、柱切换等操作。

用手动进样阀时的压力变化不大，自动进样阀由于切换较慢，可能会造成压力冲击。

合理选择分离柱。

我们知道，选择色谱分离柱主要根据两点，一是根据待测组分的分子量的大小；二是根据流动相条件，包括PH值、离子强度和溶剂极性等。

传统硅胶基质的
键合相柱要求流动相PH值在3-7之间，极端PH值（>8）的流动相能溶解硅胶，使键合相流失。

而目前利用先进的杂化颗粒技术研制的高纯硅胶颗粒填料（如Waters公司的XTerra 色谱
柱），集硅胶和多孔聚合物填料的优点为一体，使有机硅烷单元取代了相当一部分占据颗粒内部和表面位置的硅羟基，使这种新型填料具有分辨率高、稳定性强、PH范围宽（1-12
）的优势，其性能突破了传统高效液相色谱柱的极限。

所以一定要根据分析的对象、流动相的条件选择合适的分离柱，茫然时可向公司的技术人员咨询。

定期冲洗分离柱。

每次分析工作结束时，冲洗完缓冲盐后，最后要过度到用强溶剂冲洗柱子，如可用色谱纯甲醇、乙腈冲洗反相C18柱，目的是冲去吸附在柱上的强保留组分。

如果用甲醇/水为流动相也应这样冲洗柱子，在一定程度上可恢复柱效。

3．2怎样减少柱的污染？
最有效的办法是纯化样品。

我们在多年的分析工作中发现，凡是样品纯化的越干净，分离柱的寿命就越长；反之，只有提取没有纯化的样品，分离柱柱效下降较快。

建立一个
理想的色谱分析方法应该有一套有效的样品前处理方法，特别是在分析血浆和尿液样品时，要特别注意样品的提取与纯化，尽量使处理过的样品中杂质（如大分子蛋白、有机物等
）降到最低，保护柱头和柱子。

提取纯化好的样品最好用流动相来溶解，一方面减少色谱图中的溶剂峰干扰，另一方面也是检查样品在流动相中的溶解性，如果样品进样后在流动相中沉淀，会堵塞进样器和
柱头，甚至样品分解，出现怪峰。

如果出现样品与流动相不溶要设法改变溶解条件，如更换样品溶剂，或改进处理样品的方法，或过滤，去除不溶性物质。

4检测器的常见故障及对策
液相色谱仪常用的检测器主要有紫外、荧光和电化学检测器。

这些检测器的作用就是收集流经色谱分离柱的各组分在检测器中的信号，根据组分光吸收值/荧光强度/电极表面
电流的变化计算出组分的浓度[4]。

各检测器常见故障主要有：
4．1基线噪音较大和对策
对于紫外检测器，氘灯光源打开后要预热30分钟以上，基线才能稳定。

氘灯用的过久，接近受命期时（氘灯的寿命约束1000小时），会使基线噪音明显增加，应及时更换氘灯。

除光源外，流路中的气泡也会产生噪音。

怎样判断基线噪音增大是由
于光源灯的老化还是来自流路中的气泡？可将泵关上，继续走基线，如果噪音立即停止，基
线呈一条直线，说明基线噪音来自流动相中的气泡，应设法排气；若停泵后仍有噪音出
现，应考虑是灯的问题。

电化学检测器中的工作电极（安培型）对气泡十分敏感，仪器的平衡时间较长。

流路中如果有气泡存在，不仅基线会出现尖峰，还会影响检测。

因此，做电化学检测时，流动
相的配制要很严格，水要超纯、除还原物，配好后一定要过滤脱气，还应现用现配。

如果泵系统不是PK材料，即电化学分析专用仪器，而是普通的高效液相色谱不锈钢泵，应对系
统中的不锈钢材料的输液泵、进样器和管道，在分析前用6mol/L硝酸溶液钝化（注意断开分离柱），可缩短基线平衡时间。

还可在流动相中加入EDTA离子隐蔽剂，也是可以的。

如
果有较大的气泡进到检测器中，光靠泵冲有时太慢，可暂时将泵停止，关上电化学检测器，拆下工作电极，用超纯水冲洗电极表面，也很奏效的，但对液相色谱技术不太熟练的技
术员要小心操作，不宜反复这样拆卸。

4．2检测器污染及对策
管道污染阻塞是检测器常见故障。

当流动相用了缓冲盐更换流动相又不当时，常会在检测器管路中产生沉淀，可先用5倍柱积的水冲洗，再用10倍柱积的强溶剂（如乙腈）流
过，再用50倍的柱体积的异丙醇冲洗，最后换上反相流动相平衡。

当检测器管路堵塞时，可表现为柱压升高，此时，应和柱头堵塞相区分。

可断开柱子，直接接检测器，如泵压仍
较高，可判断压力升高是由于检测器管道堵塞造成。

检测器进口是常发生阻塞的地方，正向冲洗效果常不明显，我们的经验是将检测器进出口管道对调，用6mol/L硝酸溶液反冲检
测器，能很快将阻塞冲开，但要注意用低流速冲洗，观察压力变化。

检测池阻塞和污染多见紫外检测器。

池阻塞也可用上述方法反冲，一般都能疏通。

通常，池阻塞的故障比较少见，而池污染常发生，如不干净的样品在池窗上积聚等，都会造
成检测池污染。

表现为基线噪音增大，仪器灵敏度下降。

可用注射器依此回抽异丙醇、6mol/L 硝酸，要小心操作，将池中的污物冲洗干净，最后用100ml纯水正向冲洗检测池。

反向
冲洗还可防止池渗漏。

对于电化学检测器，要注意维护工作电极表面的清洁度，当检测器检测了大量较脏的样品（如血浆、尿液）或用的过久，应用化学法或物理抛光法对电极表
面进行清洁，可提高一定的检测灵敏度，但要注意，最后一定要用纯水冲洗干净，不要带来其它污染。

我们仅就有限的篇幅谈了一点从事液相色谱分析工作的经验，还有许多问题需要我们大家共同交流和探讨。

高效液相色谱仪是现代科学研究中广泛使用的分析仪器，但我们必
须学会正确的使用和维护，才能更好的驾驭它，让HPLC技术在医学领域发挥更大的作用。

怎样选择高效液相色谱柱?
现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。

但
是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。

1、正相色谱
正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团
(NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。

由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。

正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。

2、反相色谱
反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。

反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。

样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。

常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。

二、聚合物填料
聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～14均可使用。

相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。

现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。

三、其他无机填料
其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。

由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的
用途。

如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。

这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。

氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。

但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应
用PH范围1～14，温度可达100℃。

由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。

怎样选择填料粒度
目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。

粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。

如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，
3um的色相谱的背压却是5um的2倍。

与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更
短的色谱柱，以缩短分析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使
用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。

一、如何保证良好的柱性能与柱寿命
◆认证阅读色谱柱使用说明书；
◆使用填充良好的色谱柱；
◆尽量减少压力波动，避免机械及热冲击；
◆使用保护柱及在线过滤器；
◆经常以强溶剂冲洗色谱柱；
◆充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分；
◆用稳定的固定相（C18最稳定）；
◆在中等PH值操作（6~8），用有机缓冲溶液；
◆色谱柱使用温度最好小于40℃；
◆硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0；
◆在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；
◆流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%；
◆过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴最好）。

HPLC固定相及应用范围
名称别名功能基团正相反相离子对应用
Silica -OH √非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。

SAS C1 -(CH3)3 √在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留最
弱，典型用于中等极性和多官能团化合物.
Butyl C4 -C4H9 √√分离肽和蛋白质，保留时间比C8和C18短。

MOS C8，-C8H17 √√中等极性相中对中等化合物，小肽和蛋白质，
Octyl 极性药族化合物和环境样品。

ODS C18 -C18H37 √√烷基键合相中对中等极性化合物保留最强。

广
泛用于药物，甾族化合物，脂肪酸和环境样品.
CPS CN ,Cyano -(CH2)3CN √√对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相
(propyl
; 分离，当用于反相系统时，其选择性与C8和
Nitrile) C18不同，在药学领域和复杂混合物的分离中应
用广泛。

APS NH2 -(CH2)3 NH2 √√反相中分析糖类和其他极性化合物。

弱阴离子交
(Amino Propyl) 换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性
剂做流动相。

正相中与硅胶的选择性机改性剂
不同,分析芳香族效果很好。

Phenyl -(CH3)C6H5 √√芳香族化合物
Diol -(CH2)2O √√反相时，分离肽和蛋白质。

正相时，与硅选择
CH2(CH2OH)2
; 性相似,但极性较弱。

SCX 强阳离子-(CH2)2C6H4SO3H- √有机碱
交换
SAX 强阴离子-(CH2)3N+(CH3)3有机酸，核苷和核苷酸
交换
液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除
液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。

正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性
的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。

另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。

本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：
一、反相色谱柱的选择
1．柱子的PH值使用范围
反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。

但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。

一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致
键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。

一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。

同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。

如果流动相PH 较
高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH2-9或Zorbax的PH2-11.5的柱子。

2．填料的端基封尾（或称封口）
把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就
好。

如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。

3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱
戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。

PH2-9范围内兼容，低流失，高柱效。

尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品
化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。

对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有
更好的立体选择性。

（下图是Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较）
二、液相色谱柱的使用
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。

在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是
最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。

1、样品的前处理
a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

b、流动相与样品不产生化学反应
c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。

如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。

除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。

对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。

对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择
1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。

可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：
a．含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。

最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

b．流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质。

c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

三．色谱柱的维护
1.色谱柱的平衡
反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。

新柱应先使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。

请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。

每天用足够的
时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！操作步骤：
a.平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）
b.如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡；分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓
冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。

2．色谱柱的再生
长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。

可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。

建议用来冲洗柱子的溶剂体积
色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积
125-4mm1.6ml30ml
250-4mm3.2ml60ml
250-10mm20ml400ml
选择再生方法：
极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：
正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水
注意：
a.在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

b.0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全。