利用木瓜蛋白酶和α-淀粉酶澄清红茶茶汤的研究

利用木瓜蛋白酶和α-淀粉酶澄清红茶茶汤的研究
钟艳梅;曾宪录;郑清梅;何曼怡
【摘要】为得到优质红茶饮料,利用外源木瓜蛋白酶和α-淀粉酶对红茶茶汤进行沉淀澄清研究.结果表明:两种酶均能显著提高茶汤透光率,起到澄清作用,且效果相当.木瓜蛋白酶最佳反应条件为酶添加量0.3 U/mL、作用温度50℃、作用时间45 min、pH6;α-淀粉酶最佳反应条件为酶添加量30 U/mL、作用温度45℃、作用时间15 min、pH5,但在各自最佳条件下两种酶未表现出协同作用.%The clarification effect of exogenous papain andα-amylase on black tea soup were investigated. Re-sults indicated that both two enzymes were able to significantly increase the transmittance rate, and the two en-zymes demonstrated no significant difference for clarification of tea. The optimal reaction conditions for papain were:addition amount of enzyme to be 0.3 U/mL, treatment temperature to be at 50℃, treatment time 45 min at pH 6;and the optimal conditions forα-amylase were:enzyme amount to be 30 U/mL, treatment temperat ure to be at 45℃, treatment time to be 15 min at pH 5.
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2017(038)012
【总页数】5页(P83-87)
【关键词】木瓜蛋白酶;α-淀粉酶;红茶;澄清
【作者】钟艳梅;曾宪录;郑清梅;何曼怡
【作者单位】嘉应学院生命科学学院,广东梅州514015;嘉应学院生命科学学院,广
东梅州514015;嘉应学院生命科学学院,广东梅州514015;嘉应学院生命科学学院,
广东梅州514015
【正文语种】中文
在我国茶饮料生产中，茶汤沉淀问题成为制约其市场迅速发展的主要因素[1]。

现
代茶学研究理论认为，茶饮料沉淀形成主要是蛋白质、茶多酚、咖啡碱等分子间氢键与疏水作用，茶汤温度较高时，这些物质各自呈游离状态存在，但当温度降低，茶黄素、茶红素及其没食子酸酯等多酚类物质的酚羟基，可分别与蛋白质的肽键、咖啡碱以氢键结合形成络合物，从而产生茶汤沉淀即“冷后浑”现象[2]。

沉淀形成不仅会影响茶饮料的风味和外观品质，也会导致大量有效成分损失。

酶法转溶茶汤沉淀是近几年来茶饮料加工技术的研究热点之一[3-6]，目前应用较多的
酶有单宁酶（Tannase）、果胶酶（Pectase）、木瓜蛋白酶（Papain）等，宁井铭[7]的研究结果表明，单宁酶、果胶酶、木瓜蛋白酶对绿茶茶汤抗沉淀影响达极
显著性水平，经木瓜蛋白酶处理的茶汤蛋白质含量减少，氨基酸含量有一定的增加；黄彤[8]也证实了上述3种酶能减少绿茶茶汤沉淀产生，此外还发现单宁酶和葡萄
糖氧化酶具有复合作用，不仅能有效延缓绿茶茶汤贮存过程色度升高，还能显著减少茶汤沉淀产生；Coopper[9]的研究也表明，经木瓜蛋白酶处理的茶汤在0℃～2℃下过滤后，即使加入柠檬酸等物质，在低温下长时间储存也不会产生沉淀。

另外，α-淀粉酶（α-Amylase）能够分解茶汤中的淀粉物质，提高茶汤的澄清度[10]。

综合目前国内外液态茶饮料酶澄清技术来看，主要以单宁酶为主，但利用木瓜蛋白酶和α-淀粉酶来澄清红茶茶汤的研究目前还鲜见报道，本研究可为红茶饮料加工
提供技术上的支持。

1.1 材料与仪器
原料：梅州清凉山红茶加工过程中的茶叶碎（含部分茶梗）。

T6可见分光光度计：上海沪粤明科学仪器有限公司；FB224电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH.SY11-N14数显恒温水浴锅：常州华冠仪器厂；L420台式低速离心机：济南博华仪器设备有限公司；木瓜蛋白酶（Papain，100 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；α-淀粉酶（α-Amylase，20 000
U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司。

1.2 红茶茶汤制备
将红茶粉碎过40目筛，茶水比1∶20（g/mL），超声波辅助浸提20 min～30 min，浸提温度60℃，冷却后以3 500 r/min离心15 min得到红茶茶汤。

1.3 单酶源澄清红茶茶汤的研究
1.3.1 单因素试验
1.3.1.1 酶不同添加量
分别取100 mL红茶茶汤，调节pH值为6.0，木瓜蛋白酶分别按0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 U/mL的量添加，60℃水浴30 min；α-淀粉酶则分别按10、20、30、40、50、60 U/mL的量添加，60℃水浴10 min，以透光率为指标分别筛选最佳酶添加量。

1.3.1.2 酶不同反应温度
木瓜蛋白酶添加量为0.2 U/mL，设置不同水浴温度分别为45、50、55、60、65、70℃；α-淀粉酶添加量为20 U/mL，设置不同温度为35、40、45、50、55、60℃，其它条件和处理同1.3.1.1，以透光率分别筛选最佳反应温度。

1.3.1.3 酶不同反应时间
木瓜蛋白酶添加量0.2 U/mL，水浴温度60℃，设置不同反应时间分别为15、30、45、60、75、90 min；α-淀粉酶添加量20 U/mL，水浴温度60℃，分别反应5、10、15、20、25、30 min，其它条件和处理同1.3.1.2，以透光率分别筛选最佳
酶反应时间。

1.3.1.4 不同反应pH值
木瓜蛋白酶添加量0.2 U/mL，设置不同反应pH分别为3、4、5、6、7、8，60℃水浴30 min；α-淀粉酶添加量20 U/mL，pH设置与木瓜蛋白酶同，60℃水浴
10 min，以透光率分别筛选最佳酶反应pH值。

1.3.2 正交优化试验
在单因素试验基础上，分别对两种酶的添加量、水浴温度、反应时间、pH值主要影响因子进行四因素三水平的正交试验，正交因素水平设计如表1。

1.4 木瓜蛋白酶与α-淀粉酶协同作用澄清红茶茶汤的研究
先木瓜蛋白酶后α-淀粉酶（处理1）、先α-淀粉酶后木瓜蛋白酶（处理2）：两
种酶澄清红茶茶汤时均采用正交优化后的最佳试验条件，以无加酶和只加木瓜蛋白酶或α-淀粉酶作对照。

1.5 透光率测定
将酶澄清处理后的红茶汤沸水浴30 s终止反应，以3 500 r/min转速离心15
min后用锡箔纸密封，置于4℃下冷藏过夜，次日取出，待样品恢复室温后，以蒸馏水为参比，在660 nm波长下测其透光率。

T=10-A（式中：T为透光率；A为
吸光度）。

1.6 数据处理
所有数据采用Excel 2003和Originpro 8.5软件进行分析，采用Duncan法
（P<0.05）进行多重比较。

2.1 单酶源澄清红茶茶汤结果
2.1.1 酶不同添加量对茶汤透光率的影响
酶不同添加量对茶汤透光率的影响结果如图1、图2所示。

由图1、图2可知，两种酶都有一个共同特点：即在一定浓度范围内，茶汤透光率
随着酶添加量增加而升高，说明两种酶对红茶茶汤均有澄清作用，但浓度再增加时透光率变化趋势平缓甚至略有下降，原因可能是酶固体制剂过多添加，导致酶残留在茶汤中所致。

由图可知，木瓜蛋白酶最适添加量为0.4 U/mL，α-淀粉酶最适添加量为40 U/mL。

2.1.2 酶不同反应温度对茶汤透光率的影响
酶不同反应温度对茶汤透光率的影响如图3、图4所示。

由图3、图4可知，木瓜蛋白酶澄清茶汤时，在45℃～55℃范围内，随着温度升
高茶汤透光率迅速升高，在55℃时最高，但高于55℃时，透光率下降；而α-淀
粉酶澄清茶汤时也有类似情况出现，在35℃～50℃范围内，随着温度升高茶汤透光率升高，在50℃时最高，但温度进一步升高时，透光率迅速下降。

原因可能是
升温加快酶失活的效应占主导地位，特别是α-淀粉酶对温度尤其敏感。

因此，木
瓜蛋白酶的最适温度选择55℃，α-淀粉酶最适温度选择50℃。

2.1.3 酶不同反应时间对茶汤透光率的影响
酶不同反应时间对茶汤透光率的影响如图5、图6所示。

由图5、图6可知，木瓜蛋白酶作用时间在15 min～60 min范围内，茶汤透光率随时间延长而增加，当反应时间增加到75 min时，茶汤透光率有所下降，再延长到90 min时又升高，可能是时间长产生静置沉淀作用，故选取60 min为木瓜蛋白酶最适反应时间。

α-淀粉酶也出现类似现象，故选取20 min为其最适反应时间。

2.1.4 不同反应pH值对茶汤透光率的影响
pH值不但会影响酶的反应速度，还对茶汤透光率有影响，酶不同反应pH值对茶汤透光率的影响如图7、图8所示。

由图7、图8可知两种酶共同特点为：反应pH值在3～5范围内，茶汤透光率随pH值升高而显著增加，pH值为5时，两者透光率达到最大值；以后随着pH值
增加，茶汤的透光率急剧下降。

故两种酶澄清茶汤的最适pH值均选择5。

2.1.5 单酶澄清茶汤沉淀工艺条件的正交优化
木瓜蛋白酶与α-淀粉酶正交试验结果及方差分析见表2和表3。

木瓜蛋白酶澄清茶汤时，据表2极差分析结果，各因素对茶汤透光率影响的大小顺序为D＞B＞A＞C，即pH值影响最大，温度次之，酶添加量和反应时间对试验结果影响最小。

优组合为A1B1C3D3，但据表3方差分析结果可知D因素（pH 值）对茶汤透光率影响显著，其它因素则不显著。

从节约时间和能源角度出发，工艺条件经正交优化后，以A1B1C1D3组合为优，即酶添加量0.3 U/mL，反应温度50℃，反应时间45 min，pH 6。

α-淀粉酶澄清茶汤时，从表2可知各因素对茶汤透光率影响的大小顺序为D＞A＞B＞C，说明pH值是影响茶汤透光率的主要因素。

优组合为A3B3C3D2，从表3方差分析结果可知D因素（pH值）对茶汤透光率影响显著，其它因素也不显著。

从节约能源和时间角度出发，优化后的最佳工艺条件组合为A1B1C1D2，即酶添加量30 U/mL，反应温度45℃，反应时间15 min，pH 5。

对两种酶的最佳反应条件进行了验证试验，结果表明：木瓜蛋白酶澄清茶汤的透光率达到63.3%，而α-淀粉酶的也达到62.0%，具有良好的澄清效果。

2.2 木瓜蛋白酶与α-淀粉酶协同作用澄清茶汤结果
木瓜蛋白酶与α-淀粉酶协同澄清茶汤结果见表4。

两种酶的最佳反应温度、时间、pH值不一样，故不能同时添加，只能先后添加，否则会影响酶制剂的作用效果。

由表4可知，在各自最优条件下，与无加酶组对比，单独添加时，无论是木瓜蛋白酶还是α-淀粉酶，都能显著提高茶汤透光率，起到澄清作用，且两种酶效果相当。

但两种酶协同作用时，对茶汤的澄清效果并不明显，反而比各自单独添加时的透光率要降低，这一现象说明：红茶茶汤中沉淀物质的量是一定的，过多添加外源酶对沉淀物的去除未必有益，反而因酶残留造成澄清度下降。

本研究以红茶加工中产生的碎茶为原料，对其茶汤通过添加外源木瓜蛋白酶和α-
淀粉酶进行澄清处理，结果表明添加这两种酶制剂均能提高茶汤透光率，起到澄清茶汤作用，得到木瓜蛋白酶最佳添加量为0.3 U/mL、反应温度50℃，反应时间
45 min，pH 6；α-淀粉酶最佳添加量为30 U/mL，反应温度45℃，反应时间15 min，pH 5，为红茶废物利用和茶饮料加工提供技术支持和理论依据。

木瓜蛋白酶可促进茶汤蛋白质分解，减少蛋白质-茶多酚复合物形成[4]，故在红茶饮料加工中可使茶汤澄清。

α-淀粉酶能将茶汤中淀粉物质切断成长短不一的短链
糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，起到降低稠度和“液化”的作用，从而提高茶汤澄清度。

将这两种酶应用于红茶茶汤澄清，不会把有益成分去除，只是转变了物质的存在形式而已，故具有一定的应用价值和发展前景。

木瓜蛋白酶和α-淀粉酶的协同作用没有出现预期效果，可能因添加的酶量过多，
影响了茶汤透光率，可通过调整两者的添加量及比例，探讨协同效应，从而使研究结果更有参考价值。

此外还应通过感官评价两种酶的添加导致蛋白质和淀粉的减少，是否会影响茶汤的色泽、口感等。

单宁酶是目前用于茶汤澄清的主要酶制剂，但价格高、成本大，木瓜蛋白酶和α-
淀粉酶的价格相对较低，而且具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此不失为茶饮料加工中澄清剂的一种好选择。

此外我们还可以研究这3种酶的共
同作用，制作高效且性能稳定的复合酶制剂。

【相关文献】
[1]尹军峰.茶饮料提取技术及其主要影响因素[J].中国茶叶,2006 (1)：9-10
[2]曾海宾,朱俊.茶饮料沉淀机理及解决途径的探讨[J].福建轻纺, 2003,10(11)：48-50
[3]许勇泉,胡雄飞,陈建新.基于单宁酶处理的绿茶茶汤沉淀复溶与回收利用研究[J].茶叶科
学,2015,35(6)：589-596
[4]赵文净,刘祖锋.木瓜蛋白酶对白茶浸提液中茶多酚含量的影响[J].食品研究与开发,2015,36(21)：
60-62
[5]胡雄飞.绿茶浓缩汁沉淀调控技术研究[D].杭州：浙江工商大学, 2015
[6]龚玉雷.纤维素酶和果胶酶复合体系在茶叶提取加工中的应用研究[D].杭州：浙江工业大学,2013
[7]宁井铭,方世辉,夏涛,等.酶澄清绿茶饮料研究[J].食品与发酵工业,2005,31(9)：122-124
[8]黄彤.外源酶对茶汤贮存过程中品质的影响[J].湖北农业科学, 2012,51(15)：3300-3303
[9]Cooper H S.Tea product and method of making the same：US310 8877[P].1963-10-29
[10]胡国华.食品添加剂在饮料及发酵食品中的应用[M].北京：化学工业出版社,2005：213。