基因克隆技巧之---双酶切系统的具体应用实例

双酶切系统(DDDesigner)的具体应用实例
DDDesigner group
1. 避免浪费限制性内切酶
双酶切系统能够避免限制性内切酶的浪费，因为很多限制性内切
酶在实际应用中所需的用量极少。

如：
利用NEB公司的PstI-HF和EcoRV-HF两种酶消化长度为3000bp的1ug质粒DNA，当这两种酶在质粒上各只有一个切点时，完全消化质粒DNA所需要的PstI-HF仅为1.2U，需要的EcoRV-HF也仅为1.5U。

由此可见，如果按照该酶所附的使用说明用1ul酶（10或者
20IU）消化1ug质粒DNA，你将浪费了大约5-10倍的酶。

这种浪费在一些特别贵的酶上面可能体现得更明显。

2.确保质粒载体的完全酶切，降低载体自连而出现的背景克隆
由于单位定义时底物选择的不同，以及酶在底物上识别位点的数
目的差别，导致在实际工作中，切割相同的质粒DNA时，不同的酶所需要的酶量（单位数）有很大的差别，有时能够相差近30倍。

如：
利用NEB公司的PstI-HF和NheI-HF两种酶消化长度为3000bp的
1ug质粒DNA，当这两种酶在质粒上各只有一个切点时，完全消化质粒DNA所需要的PstI-HF仅为1.2U，需要的NheI-HF则高达32U，两种酶的用量相差近30倍。

因而，如果按照该酶所附的使用说明用1ul酶（10或者20IU）消化1ug质粒DNA，那么PstI-HF会出现浪费，但同时，NheI-HF的
用量则不能保证质粒DNA的完全酶切。

此种情况下，在进行载体和外源片段的连接时，就会出现大量的载体自连，导致阳性克隆率低，或
者克隆失败。

3.确保PCR产物的完全酶切，提高克隆成功率
对同样质量(如1ug)的不同DNA样品，长度短（分子量小）的DNA样品中的分子数多，因而如果这些DNA样品分子上的酶切位点数是一样的，那么完全消化较短的DNA分子所需要的酶量将会比完全酶切较大的质粒DNA多。

如：
用Takara的EcoRI和XbaI完全酶切1ug纯化的短PCR产物（300bp），且此两种酶在该分子上各有一个识别位点，那么需要大约64U的EcoRI和323U的XbaI。

因而，如果按照该酶所附的使用说明用1ul酶（10或者15IU）消化1ug DNA,那么就会导致大量的PCR产物酶切不完全，进而无法成功克隆至载体上，导致克隆失败。

这个现象也提示：在进行较短的PCR产物酶切时，可以DNA的起始量，一般0.3—0.5ug就能满总克隆的需求，从而及可以节省酶的用量，也可以保证完全酶切。

4.限制性内切酶的使用注意事项
双酶切系统在设计酶切反应时，不仅给出酶的用量，推荐合适的缓冲液，而且还给出了这些限制性内切酶使用时需要注意的事项，包括甲基化对酶切效果的影响，盐离子浓度对酶活性的影响等。

如：
这些有用的提示能够有效地避免在酶切时犯错误，保证酶切和克隆的成功率。

5.提示某些酶的特殊最适使用温度
大部分限制性内切酶的最适使用温度是37℃，但也有很多限制性内切酶的最适使用温度不是37℃，经常出现的温度包括25℃，30℃，50℃和60℃等。

双酶切系统将在显示酶切设计的同时，用红色警示那些非常规的最适温度，并在缓冲液推荐时，提醒依次在不同的温度下
完成双酶切。

如：
6.推荐最合适的酶切缓冲液
双酶切系统不仅收集了多个限制性内切酶供应商（包括NEB, Takara, MBI,Promega等）的所有关于限制性内切酶缓冲液使用情况
的信息，而且也测试了不同公司的酶和缓冲液的相互兼容性，进而构
建了一个系统而全面的数据库。

因而该双酶切系统可以对绝大部分常
见双酶切组合推荐合适的缓冲液，从而不仅能够有效节省双酶切的时间，还能有效避免可能出现的星活性（star activity）。

7.强大的限制性内切酶搜索功能
双酶切系统不仅可以用于进行科学的双酶切设计，而且该系统还
拥有非常方便使用的限制性内切酶搜索功能，包括：
1）利用限制性内切酶的名字进行搜索：在搜索结果中显示该酶的识别序列，切割位点以及供应商的信息。

2）利用识别序列进行搜素：在搜索结果中显示所有识别该序列的限制性内切酶，切割位点以及供应商的信息。

3）搜索完全同裂酶（Isoschizomers）：完全同裂酶是指识别完全相
同的DNA序列，而且切割位点也完全相同的一组限制性内切酶。

完全同裂酶搜索时显示出所有完全同裂酶的识别序列，切割位点以及供应
商信息。

4）搜索不完全同裂酶（Neoschizomers）:不完全同裂酶是指识别相
同的DNA序列，但切割位点不同的一组限制性内切酶。

不完全同裂酶搜索时显示出所有不完全同裂酶的识别序列，切割位点以及供应商信息。

5）搜索同粘酶:限制性内切酶消化DNA后一般会产生三种粘性末端（overhang）:5`端突出的粘性末端，3`端突出的粘性末端或平末端。

一般将酶切DNA后产生相同粘性末端的一组限制性内切酶称作同粘酶。

同粘酶在设计一些较复杂的克隆或载体改造时非常有用。