第2章 高效液相色谱分析法

4. 选择流动相时应注意的几个问题
（a）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质 长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（b）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧 化铝固定相等。）
（c）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
信号采集/转换器
检测器
A泵
B泵
(2) 梯度洗脱装置
•利用两台高压输液泵，将两种 不同极性的溶剂按一定的比例送 入梯度混合室，混合后进入色谱 柱。
•可以根据设定的程序改变溶剂 配比，从而改变流动相的极性。
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
a. 准备状态：样品装入样品环，流动相不进入样品环； b. 进样状态：流动相流进样品环，将样品带入色谱柱。
液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型载体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。
（2）表面多孔型载体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的
(4) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
分离柱填充物的种类多样，分离机理各不相同，可将高 效液相色谱法分为：液固吸附色谱法，液液分配色谱法，化 学键合色谱法，离子交换色谱法等。（后面详细讲解）
(5) 液相色谱检测器
a. 紫外-可见光检测器 应用最广，有紫外-可见光吸收的有机化合物均可检测。 工作原理类似紫外-可见分光光度计，基于朗伯比尔定率： A=lg(1/T)=kc A -- 吸光度 c -- 样品浓度
乙醇，玫瑰精油，-淀粉酶，脂肪酸，多糖
有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药 残留量进行分析。
2. 液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography
问题：两个峰出峰时间相隔太远。 方法：增加流动相极性；增加流动
解决办法：使用梯度洗脱。
பைடு நூலகம்
液相色谱-质谱联用
样品
色谱
接口
质谱
计算机处理系统
结果
M+
质谱检测
N+
A
O+
B
P+
色谱分离
.
样品
C
.
D . . .
课堂作业
什么是梯度洗脱，梯度洗脱的特点及应用。 什么是正向柱和反向柱？在正相液相色谱的分离过程中, 极性 _ _的组分先流出色谱柱, 极性_ __的组分后流出色 谱柱。 下列几种物质，应选择哪种色谱进行分析？
仪器分析
3 高效液相色谱法
定义：
以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为液相色谱仪； 采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的 液相色谱仪称为高效液相色谱仪。 组成部分：
高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统
本实验室的高效液相色谱仪（岛津 LC-10A）
3.1 流程
液体流动相
色谱柱
b. 光电二极管阵列检测器
紫外光进入流动池，从流动池出来的光再经分光系 统、狭缝照射到一组(1024个）光电二极管上，数据收 集系统实时记录下组分的光谱吸收，得到三维的立体谱 图。
用一组光电二极管同时检测透过样品的所有波 长紫外光。它具有以下优点:
可得任意波长的色谱图，极为方便; 可得任意时间的 光谱图，相当于与紫外联用，从而得到时间-波长-吸光度 的三维图谱。
5. 尺寸排斥色谱 size- exclusion chromatography
原理：按分子大小分离。小分 子可以扩散到凝胶空隙，由其中 通过，出峰最慢；中等分子只能 通过部分凝胶空隙，中速通过； 而大分子被排斥在外，出峰最快 ；溶剂分子小，故在最后出峰。
全部在死体积前出峰； 可 对 相 对 分 子 质 量 在 100-105 范围内的化合物按质量分离。
常用正相柱：固定相为极性，官能团主要有-CN, -NH2等，后 者常称为氨基柱，主要用于极性物质的分离纯化，如蛋白质、 氨基酸等。
常用反相柱：固定相为非极性，最常用的有ODS柱（C-18柱） 填料为十八烷基硅烷，在反相色谱可完成高效液相色谱70～ 80%的分析任务，在生物化学分析工作中应用的最为广泛。
进样器
信号输出
高压输液泵
检测器
废液
3.2 特点
特点：高压、高效、高速、高灵敏度 适用范围广，特别对高沸点、热不稳定有机及生化试样的 高效分离分析具有极大的优势。
3.3 主要部件
(1)高压输液泵 主要部件之一，用于输送液体流动相。 高柱效的固定相粒度很小（<10m），液体的流动相高速 通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色 谱的特点之一,由高压输液泵实现。 可单泵使用，也可双泵使用，双泵可实现梯度洗脱。
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂：乙腈、甲醇、水、乙醇、己烷、 乙酸乙酯等。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的 极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。
4. 离子交换色谱 ion-exchange chromatography
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶 液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应； 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存 在形式等有关。亲和力大，保留时间长。 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。
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高效液相色谱分析的应用
1.茶多酚的检测 高效液相条件： 色谱柱：Diamonsil C18（5um，250mm*4.6mm） 流动相：等浓度洗脱 CH3OH-H2O-TFA（23：77：0.05） A：甲醇（色谱纯） B：0.05%的TFA水溶液（微孔过滤超声） 洗脱程序（先等度再梯度）：23%A（20min） 10min→ 40%A(5min) 5min→ 90%A(5min) 5min→ 23%A 检测波长：280nm 流速：1ml/min 柱温：35℃ 样品含量公式： 样品含量=（标品取样量*样品峰面积*标品纯度）/标品峰面积
多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；
3 化学键合相色谱法
将各种不同基团通过化学反应 键合到硅胶（载体）表面的 游离羟基上。
化学键合固定相: 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用 最广、性能最佳的固定相；
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
c. 示差折光检测器
• 除紫外检测器之外应用最多的检测器； • 每种物质具有不同的折光指数； • 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数
差值。差值与浓度呈正比。
d. 荧光检测器
检测对象：对具有荧光特性的物质进行检测；有的物质本 身无荧光，但可与荧光试剂发生反应生成荧光 衍生物，可用于检测。
色谱图 1. 25%甲醇溶液
2. 23%甲醇溶液
2. 图形分析
气相图：
存在的问题：峰型不规则，有拖尾现象。 可能的原因：色谱柱温度偏低；色谱柱柱效较差；流动
相流速偏低；进样速度慢。
解决办法：升高柱温度；对柱子进行老化（高温加
热）；增大流速。
液相图：
C-18柱（ODS柱) 可能的原因：流动相极性偏大、流速偏小。 解决的办法：降低极性，增加流速。
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即 流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase）， 反 之 ， 流 动 相 的 极 性 大 于 固 定 液 的 极 性 （ 反 相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反。
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药、药物、氨 基酸、甾类化合物等有明显优势。
（6）液相色谱流动相
1. 流动相特性 （a）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。
流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （b）亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小 于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （c）若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相液液色 谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺 序相反。
（d）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时，流动相不应有紫外吸收。
3.4 主要色谱分离类型与基本原理
1 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography
固定相：为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10m的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。
也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短。
常用溶剂的极性顺序：
水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳> 环己烷>己烷>煤油(最小)