土壤镉胁迫下菲降解菌的筛选、特性及对微生物群落影响的研究

上海交通大学
硕士学位论文
土壤镉胁迫下菲降解菌的筛选、特性及对微生物群落影响的研
究
姓名：降巍
申请学位级别：硕士
专业：农药学
指导教师：***
20081201
土壤镉胁迫下菲降解菌的筛选、特性及对微生物群落影响的
研究
摘要
土壤是环境的重要组成部分，承担着环境中来自各方面的污染物质。

随着经济迅速发展，越来越多的污染物进入土壤环境造成污染，多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbon , PAHs）与重金属是土壤环境中重要的污染物，开展两者复合污染的研究对生态环境保护和治理有重要的意义。

本文以多环芳烃菲和重金属镉为目标污染物，采用生物富集法，从重金属－多环芳烃复合污染土壤中筛选耐受镉的菲降解菌，并对其降解、生长特性进行研究，从微生物群落功能性的角度评价降解菌对土壤的生物修复和生存能力，以期为复合污染土壤中多环芳烃生物修复提供科学依据。

主要研究结果如下：
以菲为唯一碳源并在镉胁迫情况下，通过富集培养，从多环芳烃－重金属土壤中，分离纯化得到一株菲的优势降解菌。

经16S rDNA 和系统进化分析，优势菌株鉴定为产碱杆菌属（Alcaligenes），命名为W.J。

对获得的降解菌生长特性进行研究发现，在重金属镉的胁迫下，菌株仍然能较好的生长，对数生长期为20 h。

用高效液相（HPLC）仪测定降解菌的降解率，结果表明，W.J
菌株对菲有较高的降解率，在培养5 d后，W.J能在30mg/L镉胁迫下对菲的降解率达到45％.
用BIOLOG 生态板测试土壤微生物群落代谢功能，发现添加菲的处理组的样品，颜色变化率（AWCD）显著低于对照组，表明在菲单独或者与镉同时作用下，土壤微生物利用碳源的能力降低，菲显著影响土壤微生物群落代谢功能多样性；
添加降解菌的处理组的土壤微生物群落代谢功能多样性和丰富度与对照组没有明显的差距。

通过对土壤微生物群落对各种碳源的代谢强度方差分析得出：菲能影响土壤微生物对22（共31）种碳源的利用，加入降解菌后，土壤微生物仅对4种碳源的利用能力有所下降，这表明降解菌能够明显的改善土壤中微生物群落代谢的功能多样性。

关键词：菲,镉,降解菌,生物修复,土壤,微生物群落
ISOLATION AND CHARACTERISTICS OF SOIL CADMIUM TOLERANCE AND PHENANTHRENE DEGRADING BACTERIA
AND STUDY ON ITS INFLUENCE TO DIVERSITY OF SOIL
MICROBIAL COMMUNITIES
ABSTRACT
Soil plays an important role in commit the various pollutants in environment. With the rapid development of the economic, more pollutant emitted to the environment, which cause more soil pollution. Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) and heavy metal are important pollutants. It is important to carry out research on Eco-environmental protection and remediation to the pollution caused by their compound pollution.
The research took Phenanthene (Phe) and Cadmium (Cd) as the tested pollutant. The bacteria were acquired form the soil which was polluted by PAHs and heavy metals, and the bacteria had the efficient biodegradation to degrade Phe in the presence of Cd.Then carry on a further research about degradation bacteria to study about the characteristic of degradation. Analyze the microbial functional diversity to evaluate the bioremediation and liability of the degradation bacteria W.J. Hope to offer the science basis for biodegradation about the PAHs in
compound pollution’s soil. Get a result as follows:
With the Cd, a bacterium was separated from the compound polluted soil which can use Phe as sole carbon source. After 16S rDNA, the sequence and system evolvement analysis, this bacterium was authenticated as Alcaligenes, and named W.J.
The curves of growth on different concentration of phenanthrene and cadmium showed that the period of logarithm growth is 0~20h and high concentrations of cadmium has no obvious toxicological effects to the growth.
The degradation HPLC analysis results showed that the strain W.J has strong capable in degrading Phe and the degradation rates were about 45% after 5 days in the presence of Cd.
Soil microbial community function was assessed with the Biolog method. The results showed that soil microbial metabolic diversity in CK was significantly higher than that in the soils in which Cd, Phe, W.J or their combination was added. It indicated that Cd, Phe has significantly negative effect on the sole-carbon-source metabolic ability of soil microbial communities, particularly when both of them were present.
Application of degradation bacteria incubation makes soil microbial communities same as control. Variance analyze of soil microbial communities metabolic ability to 3l sole carbon source shows that Phe have significant negative effort on 22 out of 31 sole-carbon-source
metabolic ability. After the application of degradation bacteria, only 4 sole-carbon-source metabolic ability decrease. It shows that the incubate application has a considerably effect in soil communities reversion. Keywords: Phenanthene, Cadmium, Degradation Bacteria, Bioremediation, Soil, Microbial Communities
上海交通大学
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学位论文作者签名：降巍
日期：2009年2月 25日
上海交通大学
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本学位论文属于
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学位论文作者签名：降巍指导教师签名：陆贻通
日期：2009年2月 25日日期：2009年2月 25日
第一章引言
1.1土壤复合污染
1.1.1复合污染的概念
复合污染在概念上，并不等同于“污染物+污染物”；复合污染应该同时具有以下三个基本条件：（1）一种以上的化学污染物同时或先后进入同一环境介质或生态系统同一分室；（2）化学污染物之间、化学污染物与生物体之间发生交互作用；（3）经历化学和物理化学的过程、生理生化过程、生物体发生中毒过程或解毒适应过程等三个阶段[2]。

因此，可以简单地理解为，复合污染是指存在于同一环境介质或生态系统同一分室的两种或两种以上的不同性质的环境污染物之间发生联合作用的现象[3, 4]。

1.1.2土壤复合污染
土壤是环境的重要组成部分，不仅为植物、动物和微生物提供了栖息场所，同时又是人类农业生产的基础。

土壤环境位于自然环境的中心位置，承担着环境中大约90％的来自各方面的污染物质。

随着经济迅速发展，越来越多的污染物进入土壤环境，对土壤造成污染，甚至通过污染地下水以及污染物的迁移，对人类赖以生存的生态环境，在多个层面上造成不良胁迫与危害[5]。

常见的土壤污染物主要有：重金属、挥发性芳香化合物、多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbon, 简称PAHs）、农药、酚类化合物、含硫无机化合物、含氮无机化合物等。

这些污染物主要来源于开采、冶炼、焦化、木材保护性处理、污灌、固体废弃物、农药、化肥施用等。

其中，在大多数污染地区，重金属和有机污染物（农药）是两类最为普遍且经常共存的土壤污染物[5-12]。

对于有机污染物-重金属复合污染的进一步研究，无疑扩展了土壤污染化学、土壤复合污染的研究课题，有助于有效地对复合污染进行监测、治理和修复，有助于更好地理解复合污染条件下污染物质的迁移、转化和累积规律，有助于更加全面、系统和准确地阐明生态破坏、环境问题与人类健康的实质。

20世纪70年代以来，土壤环境中多种污染物共存并发生相互作用而形成的复合污染现象已逐渐得到国内外学者的广泛重视，成为环境科学发展的一个重要
方向之一[3, 9, 13]。

对复合污染的研究意味着从根本上去寻找污染治理的良策和达到综合治理与生态平衡的目的[9]，然而，由于复合污染的复杂性和实验手段的局限性，这一领域至今仍是一个尚未克服的领域[10, 11]。

复合污染的研究最早源于药物学中二种药物联合毒性的研究，后逐渐推广到化学物质联合毒性的研究，而真正复合污染的研究则始于上世纪70年代初[14]。

单一污染物的研究成果和方法是复合污染研究的基础，由单一污染物的研究向复合污染研究的发展，既是现实环境问题的要求，也是环境科学走向成熟的标志。

多环芳烃和重金属都是环境中的微量持久性污染物，往往同时或先后进入土壤中，在环境中往往可以同时被检测到。

目前，由重金属和多环芳烃在土壤中联合作用引起的复合污染现象已引起各国科学家的高度关注。

有关大量研究已深入了微生物学过程中交互作用，特别是在污染物跨膜和代谢（脱毒）过程中的相互作用。

Gogolev(1994)[15]等发现，多环芳烃能改变细胞膜的通透性，从而加大重金属的毒性。

Maliszewska-Kordybach(2003)[16] 等研究表明，在重金属－多环芳烃复合污染中，重金属对土壤微生物活性具有抑制作用，抑制了微生物对多环芳烃的生物降解作用。

Shen(1995a,1996b）[17]报道了大肠杆菌(Esherichiacoli ATCC33456) 和假单胞杆菌（Pseudomonasputida DMP-1）混合菌对酚和Cr6+复合污染的共脱毒作用，并筛选发现了可同时降解多环芳烃萘和还原重金属Cd6+的混合菌Bacillus sp K1和Sphingomonas paucimobilis EPA505。

对重金属与多环芳烃复合污染脱毒过程中互作机制研究表明，多环芳烃可作为供电子体催化重金属还原，从而达到微生物对多环芳烃和重金属共脱毒作用。

世界卫生组织（WHO）于1980年召开关于工作环境中多危害接触的联合作用的研讨会，1986年，WHO的一个专家委员会在日内瓦讨论了致癌物联合作用的评价问题，同一年，美国统计学会(Statistical Association)和环保局（EPA）联合举办了预测多化学物毒性统计方法的会议。

在上述一系列会议记录和文件中，都反复强调一个事实，即人类是暴露在一个复杂的多元介质中，过去在对单一污染物研究基础上制定的环境标准，可能由于污染物间的拮抗，加合或者协同作用，在应用中遇到许多困难，需要加以修订，因而，采用现有的对单一污染物的标准进行复合污染评价当然也是不合理的，鉴于这种情况，开展复合污染研究，已经成为环境科学领域的当务之急[18] 。

1.1.3复合污染在土壤中的交互作用形式及特点
土壤中有机污染物-重金属复合污染既是普遍存在又是非常复杂的，实际体系中所有这些过程都不是孤立的，而是同时存在于交互作用的总过程之中。

有机污染物－重金属在土壤中的交互作用主要包括三种形式。

第一，有机污染物－重金属在土壤中吸附行为的交互作用；第二，有机污染物－重金属在土壤中化学作用过程的交互作用；第三，重金属－有机污染物在土壤中的微生物过程[19]。

⑴吸附
土壤是一个由无机(粘土矿物)、有机(腐殖酸类)以及有机－无机胶体所组成的胶体体系，具有较强的吸附性能。

有机污染物和重金属在土壤中存在着对吸附点位的竞争，它们在环境中的同时出现往往会在吸附行为上形成交互作用。

有机污染物在土壤中的吸附点位主要是土壤中的腐殖质部分[20]。

土壤中有机质的碳链结构所构成的疏水微环境，对有机污染物质的吸附起着非常重要的作用。

有机化合物通过在这些疏水微环境与水界面上的分配而被吸附在土壤表面。

疏水性的有机污染物在土壤中的吸附系数往往与土壤中有机碳的含量相关。

可是对于疏水性较差的极性有机污染物，例如，许多极性农药，它们在土壤中的吸附系数较之疏水性强的有机污染物要小得多[21]。

这些物质往往通过在土壤或粘土矿物表面发生静电作用以及形成氢键等方式产生一定量的吸附。

重金属在土壤中吸附行为的影响因素非常多，概括起来主要有土壤的阳离子交换容量、粘土矿物组成、有机质质量分数、重金属离子本身的电荷性质、价态、水合半径以及平衡介质的酸度等[22]。

重金属的存在通常不会影响有机污染物（特别是分子形态存在的有机物）在土壤上的吸附，它本身在土壤有机质上的吸附则主要是通过与有机质官能团之间的络合作用而产生的，其中汞、铜、镍和镉等具有比较强的络合能力，其络合点位主要为羧基、羟基以及胺基等；而极性有机污染物可以通过静电作用以及在土壤中的粘土矿物上形成氢健等方式被吸附在土壤表面，从而与重金属发生竞争吸附[23]。

⑵化学过程
从化学角度来考虑，重金属－有机污染物在土壤中的交互作用过程主要包括络合、氧化还原以及沉淀等，这些过程的发生对其在土壤中的交互作用有非常重
要的影响。

有机污染物与重金属共存，其直接的结果就是可能形成重金属－有机络合物，这些络合物将显著改变重金属以及有机污染物在土壤中的物理化学行为，从而使得土壤表面对重金属的保持能力、水溶性、生物有效性等发生一系列的影响；另外，一些重金属还能与有机污染物作用而导致有机化，例如，汞、锡等可与有机污染物发生作用而生成毒性更大的金属有机化合物（甲基汞、三甲基锡等）[24]。

⑶土壤微生物
污染物在土壤中的作用不仅包含物理的和化学的过程，同时也包含生物过程。

由于土壤中微生物的普遍存在，因此考虑重金属-有机污染物的交互作用必须要同时考虑微生物在其中扮演的角色。

一般认为，重金属-有机复合污染对土壤生物学过程的作用，主要是通过影响酶的活性从而间接影响有机污染物的降解。

另一方面，它们也通过改变土壤的氧化还原能力从而影响对有机污染物-重金属的交互作用。

通常，重金属污染容易导致土壤中酶活性的降低，呼吸作用减小，氮的矿化速率变慢，有机污染物降解半衰期延长等[25]。

当然，重金属对土壤中微生物活性的影响，也与重金属种类以及土壤类型、有机污染物的结构等有关。

例如，镉的存在对污泥的分解有非常明显的减缓作用，可是它对葡萄糖、纤维素的作用就非常小，原因是镉的加入导致它在有机质上的吸附，从而使有机质的分解速度变慢[26]。

1.2多环芳烃污染来源、毒性和污染现状
1.2.1多环芳烃污染来源
多环芳烃是一类普遍存在于环境中的有机污染物，具有致突变、致癌特征，它是指分子中含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物，可分为芳香稠环和非芳香稠环型，目前环境污染研究中的多环芳烃一般指芳香稠环型，其中16种多环芳烃化合物已被美国环保局列入优先控制有机污染物黑名单中。

环境中的多环芳烃来源途径广泛（图1-1），主要分为天然来源和人为来源两种，天然来源主要有微生物和高等植物，火山活动、森林火灾也产生一定量的多环芳烃。

图1-1.环境中多环芳烃主要的来源和去处
Fig 1-1 Source and destination of PAHs in environment
人类活动是环境中多环芳烃的主要来源，大多来自化学工业、交通运输和日常生活等方面，如：媒、石油、木材及有机高分子化合物的不完全燃烧时都能产生多环芳烃，这些污染物进入大气环境后，绝大部分通过沉降进入土壤，污染土壤环境，据估计，有90％的多环芳烃在土壤表面残留。

如日本曾测得人烟稀少地区的土壤中含苯并[a]芘0.07至11µg/kg，而大阪市区土壤中含苯并[a]芘达1.19至4.93mg/kg，后者比前者高约100倍，主要原因是城市中工业排出的废气、废渣和废液。

另外，汽车废气、道路尘土及炉灶烟尘等都是其污染来源[27]。

1.2.2多环芳烃污染毒性
1761年，John Hill发现鼻咽癌与多环芳烃相关，140年后又有许多人研究表明焦油能诱发肿瘤。

多环芳烃具有较高的稳定性，随着苯环数量增加，其脂溶性增大，水溶性降低，熔点升高，稳定性越长，生物可降解性越低，遗传毒性越高，其致癌性随着苯环数的增加而增强[28]。

Sutherland JB (1990,1992)[29, 30]低分子量的多环芳烃，例如萘、芴、菲和蒽，对鱼类、藻类等水生有机物有显著的急性毒副作用，而高分子量多环芳烃没有该作用，但是一些高分子量多环芳烃是致癌物质。

通过吸入空气中附有多环芳烃的尘埃颗粒(Koeber R,1999)[31] 或者摄入被多环芳烃污染的鱼类入人体后贝类、蔬菜等(Wagrowski DM, 1997)[32]，人类均可接触到多环芳烃。

多环芳烃进被细胞色素P450(CYP)lAl/1B1酶激活，形成和DNA相结合的加合物，这是多环芳烃发挥致癌作用的关键一步[33]。

最
近研究还表明，苯并(a)芘等多环芳烃能抑制单核细胞向巨噬细胞转变，破坏人体的免疫系统(Van Grevenynghe J,2003)[34]。

人类自身缺乏代谢多环芳烃的能力，所以，采取积极的措施去除环境中的多环芳烃污染物是十分重要的。

1.2.3多环芳烃污染现状
我国的多环芳烃污染主要体现在土壤、大气、江河沉积物等方面。

土壤的污水灌溉是造成土壤污染的主要途径。

1984年刘期松[35]报道沈抚灌区水稻田由于30年的石油污水灌溉，1982年测得多环芳烃总量达到631.9mg/kg（表层土）；2001年冯晓琼等[36]报道北京城郊土壤中多环芳烃的浓度高达104µg/kg（土壤中多环芳烃背景值10～20µg/kg）；2002年张天彬等[37]报道采集东莞市各地土壤样品分析，结果显示土壤中16种多环芳烃平均含量为413µg/kg，含量较高的几种组分分别为菲、荧蒽、苯并[β]荧蒽、芘等；2005年俞飞[38]报道南京焦化化工厂厂区土壤中多环芳烃含量竟然达到17638.1µg/kg；2006年王宣等[39]对六种典型区域土壤中多环芳烃检验发现多环芳烃总量浓度均值在55.3～85.2µg/kg之间，其中污水灌溉区的平均浓度最高。

大气中多环芳烃含量也相当高，1998年测得长江南京段沉积物多环芳烃总量在213.8～550.32ng/g。

许珊珊[39]2005年根据国内多环芳烃的主要来源和相关排放因子和相关排放活动的统计资料，研究了解到1999年16种多环芳烃的全国排放总量为9799t，其中7种致癌性多环芳烃排放总量约为2000t。

1.3镉污染来源、毒性和污染现状
镉是一种淡蓝而具有银白色光泽的金属，溶点321℃，沸点767℃，质软耐磨，抗腐蚀。

镉在潮湿的空气中会缓慢氧化，加热易挥发，其蒸气可与空气中的氧结合成氧化镉。

在高温下，能与卤素直接反应，生成卤化物；但不能直接与氢、氮、碳反应。

镉易与多数重金属形成合金。

镉不溶于碱，但溶于硝酸、热盐酸和热硫酸而成相应的盐。

金属镉本身无毒，但其蒸气有毒，化合物中以镉的氧化物毒性最大，而且属于累积性的[40]。

1.3.1 土壤中镉的来源
1）大气中镉的沉降：大气中的镉经自然沉降何雨淋沉降进入土壤。

如瑞典中部Falun市区的镉污染，它主要来自于市区铜矿工业厂、硫酸厂、油漆厂、采
矿和化学工业产生的大量废物，由于风的运输，这些细微颗粒中的镉，从工业废物堆扩散到周围地区。

此外，大气镉的干湿沉降也可以引起土壤中镉的含量增高。

大气镉通过干湿沉降进入土壤后，被土壤中的黏土矿物和有机物的吸附或固定，富集于土壤表层，或为植物吸收而转入土壤，造成土壤镉浓度的升高。

2）农药、化肥和塑料薄膜的施用：施用含有镉的农药和不合理施用化肥，都可以导致土壤镉的污染。

据统计，磷肥中平均镉量7mg/kg，给全球带入约66万公斤镉。

我国广西的磷矿含镉量很高，平均达174mg/kg。

据估计，西方国家的人类生活堆土壤镉的贡献，磷肥占了54％～58％。

农用塑料薄膜生产应用的热稳定剂中含有镉，在大量使用塑料大棚和地膜过程中都可以造成土壤镉的污染。

3）污水灌溉：污水灌溉是使用经过一定处理的城市污水灌溉农田森林和草地。

由于工业化发展，大量的工业废水涌入河道，是城市污水中含有的许多重金属离子，随着污水灌溉而进入土壤。

4）污泥施肥：污泥中含有大量的有机质和氮、磷、钾等营养元素，同时也含有大量的镉，随着大量的市政污泥进入农田，使农田中镉的含量在不断增高。

5）含金属废弃物的堆积：含金属废弃物种类繁多，不同种类其危害方式和污染程度都不一样。

污染的范围一般以废弃堆为中心向四周扩散。

6）金属矿山酸性废水污染：金属矿山的开采、冶炼、重金属尾矿、冶炼废渣和矿渣堆放等，可以被酸溶出含镉离子的矿山酸性废水，随着矿山排水和降雨带入水环境或直接进入土壤，都可以间接或直接的造成土壤镉污染[41]。

1.3.2镉污染的危害
镉可以在植物体、动物体、人体内大量积累，[42]危害动植物和人类的健康，引起人和动物的一些疾病，甚至造成死亡。

研究表明，镉是一种容易以危险的含量水平进入人体的高毒性重金属元素，镉被人体吸收后主要分布在肝与肾中，与低分子蛋白质结合成金属蛋白，镉中毒主要表现为肾脏功能的损害和肺部的损伤，导致肾皮质坏死、肾小管损害、肺气肿、肺水肿，还可以引起心脏扩张和高血压，长期摄入镉将会导致骨质疏松、脆化、腰病、脊柱畸形。

此外，镉还可以导致男性生殖系统损害，雄性激素增高的发生率，随接触水平的升高而增加，前列腺特殊抗体的发生率也同时增加。

土壤
中的镉主要是以交换态镉、专性吸附态镉、铁锰氧化结合态镉和残余态镉的形态存在，虽然土壤镉污染对人体没有造成直接性的接触危害，但污染土壤中的镉可以通过食物链进入人体以对人体造成严重的危害。

日本富山县妇负郡妇中镇附近，曾经是著名的米粮川，但从1926年前后发现稻谷生长不良，同时该地区出现一种以骨骼疾患为特征的患者，这种怪病最初是腰、手、脚等关节疼痛，几年后加重，大腿痉挛，行动不便，骨骼致畸变脆，稍动便发生骨折，甚至呼吸也痛苦难忍，病人最后在极度痛苦中死去，当时称此种病为“骨痛病”。

从许多研究证据表明：中毒者肾脏中含有大量的镉。

在第二次世界大战初期，美国等国家由于锡矿资料不足，电气冷藏库的制冰皿等以镀镉容器代用，也发生不少中毒病例。

英国也曾发生64起急性中毒，其中10人死亡，同样从事电镀、碱蓄电池的工人也发现过慢性中毒现象，初期有咳嗽、多痰等症状，以后发展为肺气肿。

若将痰咽至腹中，则发生食欲不振、呕吐、腹泻等肠胃病，特别是引起肾功能损伤，肾结石、贫血等病。

美国不少研究资料表明：在锌镉含量比较高的地区里，高血压发病率高，并且与心脏病之间有一定的联系，甚至致癌，这些都要引起我们的重视，并引以为鉴[42]。

1.3.3我国农田镉污染现状
早在十多年前，我国明确认定的镉污染区就超过20个，并且有11处污灌区土壤镉含量达到了生产“镉米”的程度。

如沈阳市张士灌区因污灌曾经使2533hm2农田遭受镉污染（土壤镉含量>1.0mg/kg），其中严重污染面积（可能产生镉含量>1.0mg/k的农作物）的农田占13%;江西大余县污灌区引起的镉污染面积曾达5500hm2，其中严重污染面积占12%[43]。

1.4复合污染对土壤微生物的生态毒理效应
土壤微生物是地球上包含最多单体数量、最复杂生物多样性、最大生物量的一种生物群体，据估计，每1000g土壤中可能含有5000亿个细菌，100亿个放线菌和近10亿个真菌。

这些土壤微生物是土壤中物质转化的媒介体[44]以及生物圈能量流动和物质循环的主要参与者，它们对地球生境的持续和人类的生存起到决定性作用[45, 46]。

开展复合污染条件下土壤微生物的生态毒理效应研究，建立复合污染微生物诊断指标，近年来已成为复合污染微生物生态学的一个重要内。