转染野生型p53基因对苯并芘诱导的肺癌细胞生物学特性及其原发性耐药的作用

作者单位：!"#"$#广州医学院附属第一医院广州呼吸疾病研究所
·论著·
转染野生型%!&基因对苯并芘诱导的肺癌细胞生物学特性及其原发性耐药的作用
都昌胡’徐军’
钟南山
’’【摘要】’目的’探讨苯并芘的代谢产物反式二羟环氧苯并芘（()*+）诱发的%!&基因突变，在肺癌发生发展中的作用，及外源性转染野生型%!&基因对肺癌细胞原发性耐药的影响。

方法’以携带野生型%!&基因的缺陷型腺病毒穿梭载体（%,-.//0123452%!&3*67），感染由()*+诱发%!&基因突变的成瘤支气管上皮细胞株，用空载体%,-.//012345为对照组。

通过软琼脂集落形成试验、细胞生长曲线实验、细胞凋亡和体外化疗药物敏感性分析等探讨野生型%!&基因的生物学效应。

结果’外源野生型%!&基因转染的肺癌细胞的集落数为
（!89:#8;）个、转染空载体组为（$$8!:$8!）个、未转染组为（$98!:&8!）个；%!&基因转染组细胞克隆形成率为#8!<、未转染组为$8!<、转染空载体组为$8&<。

%!&基因转染组的集落形成率与未转染组和转染空载体组比较差异均具有统计学意义（!值分别为&8=!"和&8=9$，"均>#8#"）；而未转染组与转染空载体组比较差异无统计学意义（!?"89"9，"@#8#!）。

外源野生型%!&基因转染肺癌细胞可诱导其凋亡；同时逆转细胞对表柔比星的耐药。

结论’%!&基因突变在肺癌的发生、发展及耐药性方面可能具有重要的作用。

野生型%!&基因替代结合抗肿瘤药物对于提高肿瘤细胞的药物敏感性，克服耐药方面可能有一定的帮助。

【关键词】’肺肿瘤；’基因，%!&；’突变；’基因，A*B ；’苯并芘
!"#$%"&’()*+),-./$+$0+’*#0/+*+),1$+")2,$%*+34$%0%)*+5$)"34(/%0+*+)067，8，6301234"30"#69，
:;6$,"<03$=$+>"（*）,24$+$60+3(5$3#(+/5*+5$45$##%#$!%&’()*&+，,!-+(，./0121’(*3&’(42+’()5&6+7839:;’<6;=$:38’38>(3<:<+<8，?:;3<@AA:B:’<8C /639:<’B ，2+’()5&6+D8C:E’B %6BB8)8，2+’()5&6+FGHGIH ，%&:(’
【?=%)4*5)】’@=A$5)0B$’CD ,/.EF /-1GD01DH 4./IJ/%!&K1J1LJE.31E MF IJ/L2N ，;2EL-FEGDELD02O ，"#2
1%DPLE1M1JQD
（I ）%FG1J1（()*+）LJ /-1E1510D%41J/DH 0.JK 3IJ31G IJE /-11HH13/,DH RL0E2/F%1%!&,.M,/L/./LDJ DJ 4I0LKJIJ/%-1JD/F%1IJE G1,L,/IJ31/D EG.K,S C$)1"3%’()*+2LJE.31E -.4IJ 0.JK 3IJ31G 3100,（"=T(+，I -.4IJ MGDJ3-LI01%L/-10LI031000LJ1，/G1I/1E MF ()*+）RL/-4./IJ/%!&K1J1R1G1/GIJ,H13/1E RL/-%U-.//0123452RL0E %!&，HD00DR1E MF ,DH/2IKIG 3D0DJF HDG4I/LDJ I,,IF IJE 3100KGDR/-I,,IFS V1JD41*67,R1G11P/GI3/1E HGD4/-D,13100,IH/1G /GIJ,H13/LDJ HDG E1/13/LDJ DH I%D%/D,L,S U1J,L/L5L/F DH /-13100,/D EG.K,RI,I0,D E1/13/1E ,L4.0/IJ1D.,0FS !$%(#)%’W/RI,,-DRJ /-I/1PDK1JD.,RL0E2/F%1%!&/GIJ,H13/LDJ LJ-LML/1E 3D0DJF HDG4I/LDJ DH /-10.JK 3IJ31G 3100,RL/-4./IJ/%!&K1J1IJE LJE.31E 3100KGDR/-IGG1,/IJE 3100I%D%/D,L,S WJ IEEL/LDJ ，/-10.JK 3IJ31G 3100,/GIJ,H13/1E RL/-RL0E2/F%1%!&K1J1,-DR1E 1J-IJ31E ,1J,L/L5L/F /D IEGLI4F3LJ （7*A ）/D R-L3-/-13100,M1HDG1/GIJ,H13/LDJ RI,G1,L,/IJ/S D"+5#(%0"+%%!&4./I/LDJ %0IF,IJ L4%DG/IJ/GD01LJ /-1E1510D%41J/IJE %GDKG1,,DH 0.JK 3IJ31G ，I,R100I,LJ 4.0/L2EG.K G1,L,/IJ31LJ /-14IJIK141J/DH 0.JK 3IJ31G 3-14D/-1GI%FS XL0E2/F%1%!&,.M,/L/./LDJ /-1GI%F 4IF 1J-IJ31/-1,1J,L/L5L/F DH 0.JK 3IJ31G /D 3-14L3I0EG.K,S
【E$2F"43%】’Y.JK J1D%0I,4,；’V1J1,，%!&；’ A./I/LDJ ；’V1J1,，A*B ；’(1JQD （I ）%FG1J1
’’苯并芘是一种广泛存在的环境污染物，我们应用苯并芘代谢物，反式二羟环氧苯并芘（()*+）诱导正常人支气管上皮细胞"=T(+，
形成恶性细胞株，并经实验证实该细胞株具有成瘤性，低分化鳞
状细胞癌，细胞%!&基因具有点突变［"］。

但关于苯
并芘诱导发生的%!&基因突变与肺癌的关系并不清楚。

我们将野生型%!&基因导入苯并芘诱变的肺癌细胞株，以观察野生型%!&基因替代对肺癌细胞生物学功能及化疗药物敏感性的影响。

材料与方法
一、试剂及材料
·=N "·中华结核和呼吸杂志$##!年&月第$;卷第&期’Z-LJ [C.M1G3B1,%LG *L,，AIG3-$##!，\D0S $;，6DS &
万方数据
腺病毒穿梭载体（!"#$%%&’()*+(!,-)./0）重组体质粒（本室构建）；12345成瘤细胞（以不同浓度的46.5多次处理人支气管上皮细胞12345形成的转化细胞，!,-基因测序表明第7外显子的第878位核苷酸发生9!:点突变，其相应密码子编码的氨基酸由精氨酸;99!亮氨酸;:9，诱变工作由广州医学院卫生教研室完成）；非小细胞肺癌（/";<;）细胞系318==（!,-基因缺失）由广州医学院实验中心李冰教授提供；胰蛋白酶，化疗药［多柔比星（0.>）、,(氟尿嘧啶（,(?@）、顺铂（..6）、依托泊苷（A6(12）］购于上海制药厂；胎牛血清、:BCDE&试剂、.>5>F?18培养基购于9CG)E4H<公司；琼脂糖购于上海IJ:K公司；细胞培养瓶及细胞培养板均购于美国;EBLCLM公司。

二、实验方法［8］
1N质粒转染12345成瘤细胞系和318==肺癌细胞：12345成瘤细胞系和318==肺癌细胞均用含1OP胎牛血清的.>5>F?18培养基，-QR，,P;K
8的条件下常规培养。

采用脂质体转染法（操作按9CG)E4H<公司说明书进行），待细胞,,P S Q,P转染!T#$%%&’()*+(!,-)./0。

实验分12345成瘤细胞空载体组（转染空载体质粒!T#$%%&’()*+）、318==肺癌细胞空载体组，12345成瘤细胞转染!T#$%%&’( )*+(!,-组（转染!T#$%%&’()*+(!,-)./0）、318==肺癌细胞转染!T#$%%&’()*+(!,-组。

转染质粒U7#后用:BCDE&提取12345成瘤细胞空载体组及转染!T#$%%&’()*+(!,-组细胞的总H/0。

取-!&H/0样品（1M F<），经OV7P琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光度计鉴定其完整性和定量后，行逆转录聚合酶链反应（H:(6;H）鉴定。

转染质粒Q8#后，分别提取318==肺癌细胞株空载体组及转染!T#$%%&’()*+( !,-组细胞总蛋白进行W’T%’BL G&E%检测。

8N H:(6;H法鉴定12345成瘤细胞转染的!,-基因*H/0转录状况：操作按照H:(6;H试剂盒说明书进行。

野生型!,-基因6;H引物序列的上游引物：,X(9;:;:90;:9:0;;0;;0:;;(-X，下游引物：-X(;::;099:99;:9909:909(,X，扩增片段U17G!；内参照磷酸葡萄糖脱氢酶（906.3）的上游引物：,X( 0;9;;0:;0;:0:;::;;09(-X，下游引物：,X(;09;;: :;0;:0;;;:;::9(-X，扩增片段21,G!。

H:(6;H反应条件：U7R U,*CL进行反转录；=UR8*CL灭活鸟类成髓细胞瘤病毒（0>A）来源的逆转录酶。

6;H反应：=UR-OT，2OR退火1*CL，27R延伸8
*CL，共UO个循环。

最后27R延伸Q*CL。

-N W’T%’BL G&E%法检测!,-基因转染的318==肺癌细胞蛋白表达水平：分别提取6T#$%%&’()*+(!,-组和空载体组转染Q8#后318==肺癌细胞株的总蛋白。

用"CM*Y公司蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。

取7O!M蛋白进行十二烷基硫酸钠（"."）(聚丙烯酰胺凝胶电泳。

用!,-单克隆抗体（)&EL’60G17O1）进行检测。

具体操作按照;5<< "J9/0<J/9:5;3/K<K9I公司的说明书进行。

UN转化细胞恶性表型及锚着不依赖性检测：用软琼脂培养集落形成试验。

按照文献［-］的方法，制备1V8P和OV QP琼脂溶液，-QR保存。

按1Z1比例将1V8P的琼脂与8[.>5>培养基（含8OP胎牛血清）混合，取混合液-*&形成底层琼脂。

实验分-组：未转染组、转染组、空载体组，分别加入成瘤细胞、转染野生型!,-基因的成瘤细胞和转染空载穿梭载体!T#$%%&’()*+细胞，细胞按照每个平皿1OOO个接种。

每组,个平皿，经充分混匀后，注入比例1Z1的OV QP琼脂和8[.>5>培养基。

遂形成双层的琼脂，在-QR、,P;K
8
培养箱内培养18S 1,\。

观察并统计集落数，计算集落形成率。

集落形成率]集落数F接种细胞数[1OOP
,N转化细胞生长曲线：取对数生长期的12345成瘤细胞，实验分空载体组、转染!,-基因组，分别转染6T#$%%&’()*+、!"#$%%&’()*+(!,-质粒。

每隔8U #计数细胞1次，连续18O#共,次，用8P锥虫蓝染色行细胞计数，并绘制细胞生长曲线。

2N转染细胞凋亡状况的分析：收集经野生型!,-基因转染Q8#的12345成瘤细胞，加入细胞裂解液（含OV1**E&F<乙二胺四乙酸，!3值7V O；OV O1*E&F<三羟甲基氨基甲烷，!3值QV2；OV O8 **E&F</Y;&）反应-O T，离心后弃上清液，加入终浓度1P的"."，并用H/0酶（终浓度,O*M F<）,2R 作用1S8#；然后再加入蛋白酶^（浓度8V,M F<），-QR处理8#。

乙醇沉淀./0，用1O!&双蒸水溶解./0，将获得的基因组./0加入含溴化乙啶（54）的1V,P琼脂糖凝胶中进行电泳（电压-A F )*），然后在紫外透射仪上观察凋亡图形。

QN转染细胞药物敏感性分析［U］：实验采用0:6(肿瘤化疗药敏实验（0:6(:;0）方法，0:6的测定采用荧光素(荧光素酶系统进行，0:6的浓度反映了培养孔中的活细胞数量。

根据化疗药物系列浓度对培养肿瘤细胞的不同抑制率，得到化疗药物的剂量(抑
·
Q
Q
1
·
中华结核和呼吸杂志8OO,年-月第87卷第-期_;#CL‘:$G’B)H’T!CB.CT，>YB)#8OO,，AE&N87，/EN-万方数据
制曲线，据此判断该肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度。

具体方法：所用化疗药物用生理盐水溶解成工作液，药物浓度分别为：!"#$%&$’()*；&+,-..%&$’()*；!!/0%1$’()*；2/+3451’()*。

将经过野生型6&0基因和空载体处理的34789成瘤细胞悬液（按照.:3$5个)孔接种）加入到由无血清;<=培养基稀释的不同浓度（.$$>、3$$>、&$>、.&>、3.%&>、4%.&>）的上述化疗药中，在培养板中培养4?@A ，然后进行<B/浓度的检测，从而判断细胞对不同化疗药物的敏感性。

三、统计学处理
实验数据用"!C "及率表示，结果用#检验及$检验。

结
果
一、转染细胞6&0’#D<及蛋白表达状况#B+/;#及EFGHFIJ KLMH 方法均证实转入的6&0基因在’#D<水平及蛋白水平均有表达（图3，.）。

注：3：分子质量标记；.：34789成瘤细胞转染6GNOHHLF+P’Q ；0：34789成瘤细胞转染6GNOHHLF+P’Q+6&0
图!R 6&0’#D<表达情况的#B+/;#检测结果
3：分子质量标记；.：73.SS 细胞转染空载体6GNOHHLF+P’Q ；0，5：73.SS 细胞转染6GNOHHLF+P’Q+6&0
图"R EFGHFIJ KLMH 结果
R R 二、软琼脂集落形成能力检测结果
连续观察3&A ，
空载体组和未转染组的细胞，接种后第.天始有细胞集落出现并渐增大增多（图0）；而转染6TNOHHLF+P’Q+6&0组的细胞接种第5天后才见散在的小的细胞集落形成（图5），第@天以后不再增加；未转染组细胞集落较大（图&）。

转染野生型6&0基因的细胞集落数为（&%5C $%1）个，较未转染组的（.5%&C 0%&）个、转染空载体组的（..%&C .%&）个少；集落形成率0组分别为$%&>，.%&>和.%0>。

6&0基因转染组的集落形成率与未转染组和空载体组比较差异均有统计学意义（$值分别为0%4&3和0%45.，%U $%$3）；而未转染组与空载体组比较差异无统计学意义（$V 3%535，%W $%$&）。

图#R 空载体组R 图$R 转染6TNOHHLF+P’Q+6&0组R 图%R 未转染组
R R 三、细胞生长曲线
连续细胞计数3.$N ，共分&个时间点，发现随着时间推移，转染6&0基因组的34789细胞的存活数和细胞的生长速度明显低于空载体组，两组差异有统计学意义（#V 0%.&1，%U $%$&；图4）。

图&R 细胞生长曲线图
R R 四、细胞凋亡分析
经过转染野生型6&0基因的34789成瘤细胞出现典型的!D<梯形状，表明外源导入野生型6&0基因诱导了肿瘤细胞的凋亡（图@）。

五、转染6&0基因的34789成瘤细胞株对化疗药物的敏感性
34789成瘤细胞株（6&0基因点突变）对&+,-及<!=耐药，对2/+3中度敏感，对!!/高度敏
·1@3·中华结核和呼吸杂志.$$&年0月第.1卷第0期R ;NXJ Y BOKFIP #FG6XI !XG ，=ZIPN .$$&，2ML[.1，DM[0
万方数据
注：!"#$%为分子质量标记；&’(：分别表示经过野生型)*+基因转染后&,、,(、(,、-,.时提取的基因组/01
图!2野生型)*+基因转染细胞凋亡情况的电泳图2感。

转染野生型)*+基因后，该细
胞株由原先对
1/!耐药而转变
为中度敏感，对其
他药物的敏感性与
未转染野生型)*+
基因的细胞大致相
同（图3）。

2讨论
2苯并芘是致
癌物前体，进入体
内经混合功能氧化
酶代谢活化，成为
致癌物质45/6，这是苯并芘代谢产物中致癌活性最强的。

它可以与/01共价结合引起/01损伤、基因突变［*］。

经45/6处理转化成的低分化鳞癌细胞株，其)*+基因发生了点突变。

通过野生型)*+基因转染，我们比较了转染前后细胞恶性度的改变。

软琼脂集落形成实验表明：野生型)*+基因转染的
图3"示转染野生型)*+基因组的&7846细胞对1/!、
//5、95:&7、*:;<的敏感性
图3=示未转染野生型)*+基因组的&7846细胞对//5、
95:&7、*:;<及1/!的敏感性
图"2&7846细胞对几种化疗药物敏感性实验结果成瘤细胞集落形成数与集落形成率显著低于未转染和空载体的成瘤细胞，提示)*+基因突变与肺肿瘤细胞的易转移性相关，这与我们在临床观察到的)*+基因突变率与肺癌的临床转移程度相关是一致的。

肿瘤细胞转染野生型)*+基因后恶性程度及转染能力下降［7］。

对转染野生型)*+基因前、后肿瘤细胞生长曲线与凋亡状况进行对比分析显示：转染野生型)*+基因的&7846成瘤细胞的生长受到了明显的抑制，出现典型的/01梯形状，表明野生型)*+基因的转染促进了肺癌细胞的凋亡。

这提示)*+基因突变可能是苯并芘诱导肺癌发生的早期分子事件；)*+基因功能消失对苯并芘诱发肺癌的临床进程可能产生重要影响。

肺癌治疗困难的原因在于部分患者本身对化疗药物不敏感及部分敏感的患者经化疗后产生的耐药。

目前临床上常用的抗肿瘤药如多柔比星、*: ;<、//5、95:&7等以及放射治疗均被认为是通过诱导)*+依赖的细胞凋亡而发挥作用的［-］。

然而肺癌组织中普遍存在)*+基因突变，推测肺癌的原发耐药可能与)*+基因突变有关。

我们应用野生型)*+基因转染&7846成瘤细胞，转染后的瘤细胞对1/!由耐药转变为中度敏感。

这些结果表明肺鳞癌细胞对1/!的原发性耐药与)*+基因突变密切相关，野生型)*+基因转染可逆转其对1/!的原发性耐药。

参考文献
&蒋义国，陈家坤，陈学敏>苯并芘（"）代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化>卫生研究，,??&，+?：&,@: &+&>
,黄培堂，译>分子克隆中常用的技术>见：萨姆布鲁克>分子克隆实验指南>拉塞尔/A，著>第+版>北京：科学出版社，,??,> &73&>
+鄂征>组织培养和分子生物学技术>北京：北京出版社，&@@*> &*-:&7&>
(B#%%C1，DE#="F.%#B!>1G5="H%I JEKL#F.%KLH%MHNJNONJP J%HJNMQ："HHNHJNMQ M%R"Q%MJ I%O%SL)K%MJ>1MJNF"MF%#/#EQH，&@@@，&?：(+&: (+*>
*/%MNHH%M$L!;，5"L1，G"MQ!，%J"S>5#%T%#%MJN"S TL#K"JNLM LT =%MUL［"］)P#%M%"IIEFJH"J SEMQ F"MF%#KEJ"JNLM"S.LJH)LJH NM5*+> VFN%MF%，&@@7，,-(：(+?:(+,>
7VRNH.%#VW，XLJ.Y1>)*+Q%M%J.%#")P TL#SEMQ F"MF%#>BE##ZMFLS X%)，,??,，(：++(:+(?>
-[LR%VA，XES%P86，Y"F$H G，%J"S>)*+:I%)%MI%MJ")L)JLHNH KLIES"J%H J.%FPJLJL\NFNJP LT"MJNF"MF%#"Q%MJH>B%SS，&@@+，-(：@*-: @7->
（收稿日期：,??(:?@:?+）
（本文编辑：高宏）
·
@
-
&
·
中华结核和呼吸杂志,??*年+月第,3卷第+期2 B.NM Y GE=%#F X%H)N#/NH，!"#F.,??*，9LS>,3，0L>+万方数据。