温度pH双响应聚氨基酸水凝胶的制备及性能研究

创新论坛DOI：10.16660/ki.1674-098X.2018.11.248
温度/pH双响应聚氨基酸水凝胶的
制备及性能研究
陈照明 张宁 刘钰 郝建原
(电子科技大学材料与能源学院 四川成都 610054)
摘 要：刺激响应性聚氨基酸水凝胶由于具有良好的生物可降解性、生物相容性、生物功能性和对外界刺激响应的特点，在生物医药和组织工程领域具有重要的应用价值。

在本论文中我们通过开环聚合合成了三嵌段共聚物甲氧基聚（乙二醇）-b-聚（L-赖氨酸）-b-聚（L-缬氨酸）（mPEG-PLys-PV），然后以其构建了具有温度/pH双重响应的水凝胶系统。

该体系的凝胶转变温度（TG）可以覆盖人体温度（37℃），并且具有良好的温度/pH双响应特性。

TEM和FTIR测试表明，共聚物中聚氨基酸的二级结构主要是β折叠结构，并且mPEG链段的脱水是体系发生溶胶-凝胶温敏转变的主要驱动力；而不同pH下共聚物以不同尺寸和形态的纳米聚集体的形式存在，这是体系具有pH敏感特性的主要原因。

将盐酸阿霉素（DOX·HCl）载入到水凝胶中后，我们研究了不同pH值下凝胶的体外释药行为，结果显示pH=5.7时药物释放速率明显快于pH=7.4。

关键词：聚氨基酸 水凝胶 温度/pH双响应性
中图分类号：TQ085 文献标识码：A 文章编号：1674-098X(2018)04(b)-0248-04
Abstract：Stimuli-responsive poly(amino acid) hydrogels have　important application values in biomedicine and tissue engineering f ields due to their good biodegradability, biocompatibility, bioactivity and stumuli-responsive property. In this paper we synthesized the triblock copolymer methoxypoly(ethylene glycol)-b-poly(L-lysine)-b-poly(L-Valine)(mPEG-PLys-PV) by ring-opening polymerization and then constructed a temperature- and pH- responsive hydrogel system. The gel transition temperature could cover the body temperature(37℃) and decreased with the increase of pH value. The TEM and FTIR measurements showedclearly that the secondary structure of the polymer solution was mainly composed of β–sheet structure, and the sol-gel transition process was mainly due to the dehydration of mPEG; while the changeable size and morphology of the copolymer aggregates with pH accounted for the pH sensitivity of the system. After loading the DOX·HCl in hydrogels, we investigated the in vitro drug release behavior under different pH values, the results showed the rate of drug release at pH5.7 much faster than at pH7.4.
Key Words: Polyamino acids; Hydrogels; Thermo- and pH-responsive
聚氨基酸的化学结构类同于人体内的多肽和蛋白质，
是当今材料领域的热点研究方向[1]。

多肽水凝胶由于其在
生物医学领域,如药物传递、三维（3D）组合工程支架和伤
口治疗[2-4]等方向中的潜在应用前景，而成为聚氨基酸材
料研究中的重要组成部分。

多肽水凝胶可以分为天然高
分子水凝胶和人工合成的聚氨基酸水凝胶。

与天然高分
子水凝胶相比，人工合成的聚氨基酸水凝胶在结构设计
的多样性、合成的可控性和功能化构建方面都具有明显优
势。

特别是可以通过组分选择和结构设计，使用不同的合
成技术构建诸如具有温度、pH、光、氧化还原和机械力等
刺激响应的智能系统[5-8]。

例如，温度响应性水凝胶是一种
随着温度变化而经历液体到水凝胶转变的材料，它们可以与细胞或药物混合并以液体形式注射到组织或损伤部位，随后转化成凝胶，用作组织工程支架或药物控释载体；pH
876543210 O
H
N
N
H
O
x
H3C
n
NH2
O
NH2
y
a b
c
d
e
f
g
h
j
k
d
ppm
c d
b
a
h
k
e,f,g
j
图1 mPEG-PLys2-PV7的1H NMR图谱
创新论坛
响应的水凝胶通常含有氨基或羧基，这可以赋予水凝胶以可变的溶解性，这有利于药物的加载、控制释放和靶向释药。

结合温度响应水凝胶和pH响应水凝胶的优点，本研究通过开环聚合合成了一种三嵌段聚氨基酸共聚物（mPEG-PLys-PV ），构建了温度/pH双响应水凝胶体系。

并对聚合物溶液的微观结构和溶胶-凝胶转变过程进行了研究。

1 实验部分
1.1 原料
聚乙二醇单甲醚（mPEG）:Mn=1000，aladdin；L-缬氨酸(Val):99％，aladdin；苄氧羰基赖氨酸（Nε-CBZ-L-Lys）：99％，西亚试剂；三光气（BTC）:99％，成都市科龙化工试剂厂；溴化氢乙酸（HBr ·CH 3COOH）：33％，梯希爱（上海）；盐酸阿霉素（DOX ·HCl）：98+％，Bide Pharmatech Ltd。

1.2 共聚物的合成
引发剂mPEG-NH 2依次引发Nε-CBZ-L-Lys NCA与L-Val NCA开环反应得到三嵌段共聚物mPEG-PLys(z)2-PV 7，再用HBr ·CH 3COOH脱保护脱去苄氧基得到mPEG-PLys 2-PV 7。

mPEG-NH 2（1g，1mmol）在9mL混合溶剂（CHCl 3/DMF=6ml/3mL）中引发Nε-CBZ-L-Lys NCA （0.612g，2mmol）开环聚合，40℃下反应24h，然后加入L-Val NCA （1.001g, 7mmol）继续反应24h。

反应结束后
用乙醚沉淀、干燥，得到白色产物mPEG-PLys(z)2-PV 7，产
率88％。

取3gmPEG-PLys(z)2-PV 7溶解在30mL三氟乙酸（TFA）中，然后与7mLHBr ·CH 3COOH冰浴反应6h，乙醚沉淀，干燥，然后在截留分子量为1000的透析袋中对去离子水透析4d，冷冻干燥得到产物mPEG-PLys 2-PV 7，产率
80％。

以氘代三氟乙酸（F 3COOD ）为溶剂，进行1
H NMR测试，计算所得产物是否与设计相符。

1.3 水凝胶的制备与凝胶转变温度的研究
共聚物mPEG-PLys 2-PV 7用磷酸盐缓冲液配成不同pH 的水溶液，然后用试管倒置法测定聚合物溶液的凝胶转变温度点并绘制相图。

升温速率为1℃/10min，当玻璃瓶倒置而样品1min内未发生明显流动时的温度认为是凝胶转变温度。

1.4 微观结构研究
利用DLS和TEM测试研究水溶液中聚合物聚集体的尺寸大小和形貌结构，利用FTIR研究其二级结构。

具体情况如下：在Nano-ZS90动态激光散射仪上测试不同pH值下水溶液中聚合物聚集体的粒径，25℃测试；使用HITACHI H-600TEM进行透射电子显微镜测试，浓度为0.1wt％，水溶液样品用磷钨酸染色；Nicolet560傅里叶红外光谱仪进行FTIR测试，氘代水溶液滴在氟化钙间制成液膜，扫描范
围为1680~1600cm -1。

1.5 凝胶机理研究
以氘代水(D 2O)为溶剂，测试变温13C-NMR来研究温度变化时PEG链段的脱水情况。

1.6 凝胶体外释药
将DOX ·HCl以1mg / mL的浓度溶解于PBS缓冲液（0.01M，pH = 7.4）中，然后在1g DOX ·HCl溶液中加入0.053g mPEG-PLys 2-PV 7，配成约5wt％的载药溶液，然后升温至37℃形成凝胶。

研究载药凝胶在不同pH （pH=5.7/pH=7.4）下DOX ·HCl 的释放曲线。

向装有1g载药凝胶的离心管中加入8mL缓冲液（0.01M，pH=5.7/7.4）作为释放液，间隔一定的时间取出6mL释放液并向其中加入等量的新鲜释放液，测试释放液的紫外吸光度，对比标准曲线确定释放液中DOX ·HCl的浓度。

整个释药过程在37℃的恒温培养箱中进行，每个释药做三组平行实验，数据采集取平均值。

最后用累积法计算
图2 水凝胶相图（5wt％）
图4 水溶液（4wt％）在不同pH下的FTIR图图3 1％水溶液TEM图
T e m p e r a t u r e (℃)
a b
c d
1
10
100
1000
10000
05
10
15
(y t i s n e t n
I ％)
Diameter(nm)
pH=3.0
pH=5.7 pH=7.4
1680
1660
1640
1620
1600
)
%(e c n a b r o s b A Wavenumber(cm -1)
69.669.569.469.3
ppm 25℃℃a℃
35℃ 45℃
pH=3.0
69.669.569.469.3
ppm
25℃ 35℃ 45℃
℃b℃
pH=5.7
69.669.569.469.3
ppm 25℃pH=7.4
45℃
℃c℃
35℃图5 凝胶转变机理及体外释药
注:a～c为4%水溶液不同pH 下的变温1C NMR;d为体外释药曲线。

释药量并绘制释放曲线。

2 结果与讨论
2.1 共聚物的合成
共聚物1H N M R 测试所得图谱如图1所示，通过对各峰面积进行积分，得到共聚物中各链段比例为mPEG ∶PLys ∶PV=1∶1.99∶7.08，即所得共聚物为mPEG-PLys 1.99-PV 7.08，与设计（mPEG-PLys 2-PV 7）基本相符。

2.2 凝胶转变温度（TG ）研究
如图2所示，凝胶温度（TG ）随着pH值的增加而降低。

水溶液浓度为5wt％时，当pH从3.0上升到8.0，TG从47℃下降到25℃。

聚合物水凝胶展现出了温度和pH双响应特性。

2.3 微观结构研究
图3为mPEG-PLys 2-PV 7水溶液的DLS和TEM图。

从DL S中（见图3（d）），我们发现当pH=3.0时，聚集体的粒径为20nm左右，随着pH值的增加，pH=5.7时粒径明显增加为20~100nm，当pH=7.4时则出现了粒径范围为100~300nm的较大聚集体。

TEM观察到的结果与DLS相符，在pH=3.0时，聚集体主要是蠕虫状结构，尺寸约为20nm，这是因为低pH下质子化的聚赖氨酸表现出良好的亲水性，共聚物中的亲水比例较大，有足够长的亲水链段（mPEG-PLys 2-）将疏水链段（-PV 7）包裹住，亲疏水界面完整从而可以自组装成蠕虫状胶束；而当pH值升高到5.7和
7.4时，赖氨酸的去质子化使聚赖氨酸具有一定的疏水性，共聚物中的疏水比例增加，疏水链段变长，不能完全被亲水链段mPEG包封，导致部分赖氨酸和酰胺键暴露出来，并且通过它们之间的氢键作用形成大的聚集体，范围从数十纳米到数百纳米。

总之，随着pH值的增加，聚集体的形态和大小发生了明显变化，这种变化是体系具有pH敏感特性的直接原因。

FTIR光谱广泛应用于聚氨基酸或聚多肽共聚物二级结构的研究。

聚合物溶液在不同pH 下的二级结构如图4所示。

从图中可以看出，在不同pH 下水溶液中聚合物的二级结构主要为β折叠，当pH从3.0增加到7.4时，红外吸收峰的位置
从1638cm -1位移到1632cm -1
，表明β折叠含量增加。

2.4 凝胶机理研究
通过变温1C NMR研究升温过程中PEG链段的脱水情况。

如图5（a~c ）所示，随着温度的升高，属于mPEG的亚甲基共振峰信号强度都在降低，说明mPEG链段随着温度的升高而脱水，进而引起聚合物的团聚，最终导致溶胶-凝胶转变。

但不同pH条件下的脱水过程存在一定差异。

当pH=3.0时，由25℃~45℃是一个连续脱水过程；当pH=5.7时，35℃~45℃的脱水速度明显慢于25℃~35℃，意味着溶胶-凝胶转变过程发生在35℃~45℃之间；当pH=7.4时，在35℃之前就完成脱水过程并转化为水凝胶。

这些结果符
(下转252页)
(a)
(b)
(c)
(d)
100R e l e a s e D O X ·H C l (℃)
Time(h)
(d)
5.3.2 提高木材综合利用率,节约环保高效利用
提高木材利用率有两方面的含义，一方面，通过新工艺、新技术、新设备的不断研发和应用，达到对木材进一步的有效利用,例如高速切削技术能有效减少加工时间和提高切削质量、生产效率；另一方面加工剩余物、“次小薪”材、废弃木材和沙生灌木等生产林产品，对使用过的木质产品经过整修、加工、物理、化学处理等途径，做到高效充分利用资源，达到提高木材的综合利用率。

5.3.3 研究木材精细加工、深加工生产技术
发展加工增值技术，对机床进行革新改造，提高锯解加工精度，加强木材工业的减量化技术、木材高效利用技术，提供大尺寸，多规格、性能优越的高附加值木材产品。

向知识密集型产业方向发展，生产出高科技含量，高附加值的新型产品。

5.3.4 培育发展人工林木材的利用
把握林木从培育到成熟所需要的生长周期,使用林业科学技术进行培育,做到林业资源的消长平衡。

根据我国人工林木材材质特点，研究出适合我国人工林木材利用的新技术，用人工林制造出性能比高、成本较低的产品，从采伐天然林为主转变到采伐人工林为主，保护天然林，促进林业可持续发展。

5.4 产业结构调整和优化
优化调整木材工业结构，对于促进我国林业资源的有效保护和合理利用，提高产业经济效益，具有重大意义。

木材工业的发展势必由其自身产业结构的不断优化和升级来实现，木材工业结构调整的目标是通过合理的林业工业结构，把有限的林木资源按照循环经济的原则，通过科学合理的加工利用交易变成资本，来推动木材工业向高度化发展，支撑林业的可持续发展，缓解我国木材和林产品供应的压力，进而实现林业的生态、经济和社会三大效益，确保可持续发展战略的实现。

6 结语
综上所述，木材工业和林业可持续发展是相互依赖和相互促进的，发展木材工业必须大力发展培育所需的林业资源，增加木材产品供给。

同时保护森林资源，在保护中发展，走发展中保护的生态经济之路，从而促进林业良性循环和可持续发展。

参考文献
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(上接250页)
合相图（见图2）。

2.5 凝胶体外释药
如图5（d）所示，在37℃下进行的体外释药结果表明，载药凝胶的体外释药有明显的pH响应性。

释药时间为48h 时，仅有36％的DOX·HCl在pH=7.4的条件下释出，而在pH=5.7的条件下却已经完全释放，这归因于水凝胶的pH 响应性，在pH=5.7的释放液中凝胶更容易降解。

3 结语
在本研究中，我们合成了一种可生物降解的聚氨基酸材料mPEG-PLys2-PV7，并构建了温度/pH双响应凝胶体系，其凝胶转变温度（TG）可覆盖人体温度37℃。

然后研究了不同pH值下的聚集态结构和溶胶-凝胶转变过程的机理并进行了水凝胶体外药物释放（DOX·HCl）。

基于其温度和pH响应特性，我们相信这种可生物降解的多肽水凝胶可以作为生物医学应用的新型智能材料。

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