手性高效液相-圆二色检测器(HPLC-CD)分析葡萄糖的绝对构型

手性高效液相-圆二色检测器(HPLC-CD)分析葡萄糖的绝对构
型
宋爽;王金辉;孙铁民;左文健;周玉波
【摘要】目的:建立确定葡萄糖绝对构型的方法.方法:葡萄糖经衍生化引入对溴苯甲酰基发色团,从粗产物中分离出β型衍生物,再用配备圆二色(CD)检测器的手性高效液相进行分析.结果与结论:D型和L型葡萄糖的卢型衍生物在手性高效液相上得到较好分离,通过β型衍生物的保留时间、色谱峰的方向(正峰或倒峰)以及在线扫描的圆二色谱图来确定葡萄糖的绝对构型.
【期刊名称】《中国现代中药》
【年(卷),期】2008(010)003
【总页数】3页(P13-15)
【关键词】葡萄糖;绝对构型;圆二色检测器;手性高效液相
【作者】宋爽;王金辉;孙铁民;左文健;周玉波
【作者单位】沈阳药科大学,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学,辽宁,沈阳,110016
【正文语种】中文
【中图分类】R2
糖是维持生命活动的最重要物质基础之一，除了已被人们所熟悉的作为结构物质和能量物质的作用，糖类作为信息分子在受精、发生、发育、分化，在神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起着重要作用，糖链被称为继核酸、蛋白质之后“第三
条生命链”［1-3］。

许多中药的活性都与糖及其衍生物有着密切的关系，尤其是糖与非糖物质结合的苷很多具有生理活性。

虽然已有许多糖类化合物被开发成新药，但对糖的结构的研究还不够充分，特别是糖的绝对构型问题，研究报道非常少。

很多研究已证实绝对构型不同的一对对映异构体常常具有不同的生理活性［4］，所以测定糖的绝对构型是非常必要的。

作者将葡萄糖甲苷化（甲醇解）后引入对溴苯甲酰基发色团，采用非手性色谱手段从衍生化产物中分离出β型衍生物，应用配
备圆二色（CD）检测器的手性高效液相进行分析，确定葡萄糖绝对构型。

因为葡萄糖200nm以上没有紫外吸收，首先需将葡萄糖衍生化，引入发色团。

反应过程及衍生化产物结构如图1所示。

参与该反应的衍生化试剂均为非手性，所以L-葡萄糖生成β型（或α型）衍生物
的产率与D-葡萄糖生成β型（或α型）衍生物的产率是相等的，则α型衍生物和β型衍生物中的对映体纯度是相同的。

因此，β型衍生物的对映体纯度与原葡萄糖的对映体纯度应是一致的。

葡萄糖衍生化反应的主产物是α型和β型衍生物，二者为差向异构体，可以采用
非手性色谱方法分离出微量的β型衍生物用于手性HPLC分析。

因为对映异构体
在手性色谱上的保留行为不同，圆二色谱呈镜像关系，所以可以用手性HPLC-CD 区分β-D-G和β-L-G，并可以通过色谱峰面积求算对映体纯度。

高效液相系统（日本JASCO）包括PU-2080输液泵和CD-2095圆二色检测器。

Chiralpak AD色谱柱（150mm×4.6mm，日本Daicel Chemical Industries）。

NMR谱用Bruker AVANCE-600MHz光谱仪和BrukerARX-300MHz光谱仪（Switzerland）测定。

D-（＋）-葡萄糖（GR-grade，美国 International Laboratory），L-（－）-葡
萄糖（纯度＞99%，美国 Sigma-Aldrich）。

对溴苯甲酸、浓硫酸、硫酸钙、氢
氧化钙、无水甲醇、二氯亚砜、吡啶（市售分析纯）。

液相用水、甲醇、乙腈（市售色谱纯）。

薄层硅胶GF254和柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）。

100mL圆底烧瓶中加入1.0g D-葡萄糖、2.0g无水硫酸钙、50mL无水甲醇和
0.7mL浓硫酸，85℃回流搅拌20h。

待反应液冷却后，用氢氧化钙调pH8～9。

静置过滤，取滤液40℃减压回收溶剂，冷冻干燥。

硅胶薄层检测反应产物，邻苯
二甲酸-苯胺显色后无斑点，说明葡萄糖已完全反应。

产物的13 CNMR数据对照
文献［5］，证实为α-D-葡萄糖甲苷和β-D-葡萄糖甲苷的混合物，无其他副产物。

5.5g对溴苯甲酸与4.0mL二氯亚砜80℃回流搅拌5h，65℃减压抽去多余二氯亚砜。

加入甲醇解产物和50mL无水吡啶，60℃搅拌12h［6］。

待反应液冷却后加入等体积的水，静置半天过滤，收集滤纸上和瓶中残留的白色胶状物。

0.14g L-葡萄糖也依照上述反应条件进行衍生化，对溴苯甲酸和二氯亚砜投入量相应减少，分别为0.5g和2.0mL。

分别将D-葡萄糖和L-葡萄糖的衍生化产物用硅胶柱色谱分离，石油醚-醋酸乙酯
为流动相，得到2，3，4，6-四对溴苯甲酰基-β-D-葡萄糖甲苷（β-D-G）和2，3，4，6-四对溴苯甲酰基-β-L-葡萄糖甲苷（β-L-G）。

二者的1 H和13 C-NMR 相同，具体数据列于表1中，与文献［6］中的β-D-G一致。

在线扫描β-D-G和β-L-G的圆二色谱和紫外光谱如图2所示。

β-D-G的圆二色
谱图与文献［7］报道一致。

β-D-G与β-L-G的圆二色谱图呈镜像关系，在
254nm处振幅最大，β-D-G为正Cotton效应，β-L-G为负Cotton效应；二者
紫外谱形一致，在254nm处有最大吸收，为获得较好的灵敏度，选择254nm为检测波长。

Chiralpak AD手性柱（150mm×4.6mm），以乙腈-水（90∶10）为流动相，流
速为1.0mL·min－1。

β-D-G与β-L-G分别进样的色谱图见图3，二者混合后进样的色谱图见图4。

葡萄糖在酸性条件下可以转化成甘露糖和果糖［8，9］，对在高温、酸溶液中的甲醇解反应的条件的选择尤为关键。

实验中考察了不同温度和酸度对反应所需时间和反应结果的影响，见表2。

衍生化产物在硅胶GF254薄层板上以石油醚-醋酸乙酯（5∶2）展开后，碘熏显色的主要斑点分别是α型衍生物（Rf＝0.7）和β型衍生物（Rf＝0.6）。

RPHPLC 分析，Venusil XBP-C18柱（200mm×4.6mm，5μm），甲醇-水（96∶4），流速为1mL·min－1，α型衍生物 tR＝13.2min，β型衍生物 tR＝8.6min。

在手型色谱中葡萄糖对映体的衍生物保留时间不同，而且由于可以根据CD色谱图是正峰或倒峰来判断为D型或L型，所以该方法不需要对照品。

在线扫描的CD 光谱图可以用来佐证。

如果待测葡萄糖为光学纯，即均为D型或均为L型，则不需要手型柱和β型衍生物纯品，只需用配备CD检测器的非手性HPLC分析衍生化产物，根据CD色谱图就可以确定葡萄糖绝对构型。

可以利用峰面积-浓度标准曲线法测出对映体衍生物的浓度，进而求算出对映体纯度。

但这种测定方法较为繁琐，我们将研究更为简便和准确的确定葡萄糖对映体纯度的方法。

【相关文献】
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