实验二微生物培养基的配制和灭菌

培养基的配制原那么
一、营养成分
总体原那么
1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养
基，
如自养型微生物：由简单的无机物质
组成
异养做生物：至少需要含有一种有机物质。
按微生物的主要类群来说，又有细菌、放线菌、 酵母菌和霉菌之分。它们所需要的培养基成分也 不同，分别称为牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号 合成培养基，麦芽汁培养基，查氏合成培养基。
对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低 压力(0.06MPa,约112.60C)，30min。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能翻开排气阀， 然后翻开灭菌器盖，取出物品。
培养基和玻璃器材的灭 菌方法
培养基和玻璃器材的灭 菌方法
间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮 沸1h，连续3d重复进展。在每两次蒸煮之间，将物品〔指培 养基〕放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮 后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。
马丁培养基-2
配制方法
称量： 称取培养基各成分的所需量。
溶化：在烧杯中参加约2/3所需水量，然后依次逐 一溶化培养基各成分。按每250ml培养基参加0. 83ml 的0.1％孟加拉红溶液。
定容： 待各成分完全溶化后，补足水量至所需体积 。
加琼脂〔固体培养基〕： 参加所需琼脂量，加热融 化，补足失水。
培养基的种类
据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一局部纯化学物质和另一局部天然
物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂〔常用凝固剂为琼脂〕的液
体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中参加2%左右的凝固剂的
培养基的配制原那么
能源
指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营 养物或辐射能。
微生物的能源谱：
能源谱：
化学物质
有机物：化能异养微生物〔同碳源〕 无机物：化能自养微生物〔不同于碳源〕
辐射能：光能自养和光能异养微生物
培养基的配制原那么
化能自养微生物的能源物质都是一些复原态的无机物 质，例如：NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+ 等，能 利用这些物质作为能源的全部是细菌，如：硝酸细菌、亚 硝酸菌、硫化细菌、硫细菌、铁细菌、硫细菌、氢细菌和 铁细菌等。这些无机养料常常是双功能的〔如： NH4+ 既是硝酸细菌的能源，又是它的氮源。〕
生长，方可使用。
配制方法和步骤
配制方法和步骤
配制方法和步骤
本卷须知
培养基配方在附录Ⅱ 按照每组的安排来配制，每人配的不一定都一样 按照书上的比例，但总量有变〔所有配方均为
1000ml量，同学们需要根据不同要求换算〕 配溶液 调PH值 加琼脂粉 灭菌 〔在教师监视下进展〕 普通微生物培养基配制可以使用自来水，在细胞
溶化：在烧杯中参加约2/3所需水量，然后依次逐一溶化培养基 各成分。
调pH：注意pH值不要调过头，以防止回调。
定容： 待各成分完全溶化后，补足水量至所需体积。
加琼脂〔固体培养基〕： 参加所需琼脂量，加热融化，补足失 水。
分装、加塞、标记、包扎：分装入试管内或三角烧瓶内。注意： 不要使培养基沾在管口或瓶口上。
分装、加塞、标记、包扎。
灭菌：高压蒸汽灭菌121．3℃，20min。
临用前，加热融化培养基，候冷至60℃左右，按每
高氏I 号培养基
产色素放线菌的别离 培养基成分 溶性淀粉 2g;KNO3 0.1g;K2HPO4 0.05g;MgSO4•7H2O
0.05g;NaCl 0.05g;FeSO4•7H2O 0.001g 〔母液〕;琼脂 2g; 自来水 100mL;pH 7.2～7.4;灭菌 1.05kg/cm2，20-25min 用量： 100-150mL/行；制备8-10个平板；2个/组〔涂布/划线 〕 制作斜面〔只需1个组制备〕：无需抗生素 配制方法 微量元素〔母液〕 pH
固体状态的培养基或农副产品培养基。
培养基的配制原那么
按照培养基的用途，可将其分为 1.加富培养基：
加富培养基是指在普通培养基里加过血、 血清、动物〔或植物〕组织液或其他营养物质 〔或生长因子〕的一类营养丰富的培养基，用 以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物
2.选择培养基： 选择培养基是根据某种或某一类群微生物 的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同 而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可 以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中
溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要流加酸或碱液
培养基的配制原那么
三、渗透压
注意营养物质要有适合的浓度，不能太低满足不了生 长的需要，太高那么渗透压太大，也会抑制微生物的 生长
培养基的配制原那么
四、氧化复原电位
氧化复原电位越高，培养基的氧化活动越强，在厌氧 菌培养中，参加复原剂，可降低自由氧的毒害。
培养基的配制原那么
氮源(nitrogen source) 但凡提供微生物营养所需 的氮元素的营养源，称为氮源。
氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质， 少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的 氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏 的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。
无机氮源：碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素
有机营养物常有双功能或三功能作用，既是异养微生 物的能源，又是它们的碳源或氮源。
辐射能是单功能的，只为光能微生物提供能源。
培养基的配制原那么
2.注意各种营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：营养物质浓度太大时对微
生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微 生物生长的需要。
各营养物质之间的浓度比：尤其是碳氮比 〔C／N〕〔碳氮比一般指培养基中元素碳与 元素氮的比值，有时也指培养基中复原糖与
100mL;pH 7.0～7.2;灭菌 1.05kg/cm2，20-25min 用量： 100-150mL/行；制备8-10个平板；2个/组〔涂布/划线
〕 制作斜面〔只需1个组制备〕：无需抗生素 配养基配方比例依次准确称取。注意：牛肉膏、蛋白胨 。
别离出来。 3.鉴别培养基： 普通培养基中参加能与某种代谢产物发生
培养基的配制方法和步骤
称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中参加所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 调pH值：用2MNaOH或2MHCl调pH，用pH试纸对照。 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 分装：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，挂上标签〔必须用铅笔写〕，注明何种培养基。 灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌
样品制备及目标微生物别离
梯度稀释：无菌操作称取检样25克土〔或25mL〕，放入含 有225mL灭菌水的玻璃三角瓶中(0.5g/5mL)，振摇30min， 即为1：10稀释液，依次做1：100、1：1000……稀释。
态可放出2.26kJ，可增强灭菌效果
空气膨胀压大于水蒸气膨胀压
培养基和玻璃器材的 灭菌方法
培养基和玻璃器材的
实验程序3: 灭菌方法 培养基和玻璃器材的灭菌方法
干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器
加压蒸汽灭菌法 其步骤如下： 1.灭菌器内参加一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。 2.接通电源，进展加热。 3. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀翻开，待排出大气后关闭 排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再翻开排气阀， 待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.当压力达15bl/in2〔即1.05kg/cm2 , 0.1MPa〕时，此时灭菌器内的 温度为1210C，维持20-30min。
培养以及分子试验中需要区别对待
实验程序2:别离培养微生物常用器 皿的准备
清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。 棉塞的制作 包装培养皿和吸管等。
湿热灭菌法原理
湿热灭菌法菌体吸收水分蛋白质较易凝固 湿热的穿透力比干热大，水的传热能力比许多非导
体的固体强 湿热的蒸汽有潜热存在，1g水在100℃由液态变为固
化学药剂消毒灭菌：
微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒 精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液， 它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。
培养基和玻璃器材的灭 菌方法
培养基配制的原那么 配制培养基的配方，及方法 培养基蒸汽灭菌原理，方法
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
AmpR细菌的别离 培养基成分 牛肉膏 0.3g;蛋白胨 1g;氯化钠 0.5g;琼脂 2g;蒸馏水
有机氮：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。
生产上常用的氮源有硝酸盐、铵盐、尿素、氨以 及蛋白含量较高的鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生 饼份、玉米浆等。
培养基的配制原那么
二.控制培养基的PH值 细菌与放线菌生长的pH在7—7.5之间， 酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。
在微生物的生长和代谢过程中，由于 营养物质的利用和代谢产物的形成与积累， 常会改变培养基的pH值，为了维持培养基 pH值的相对恒定，通常采用以下两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不
过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质 〔如维生素、血清〕，一般可 用细菌过滤器进展除菌。
培养基和玻璃器材的灭 菌方法
培养基和玻璃器材的灭 菌方法
紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次翻开紫外线照射0.5h，就 使室内空气灭菌。假设照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂， 可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使 一薄层玻璃或水层就能将大局部紫外线滤除，因此只适用于空气 及外表杀菌。
(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜 面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝
马丁培养基
淀粉降解真菌的别离 培养基成分 葡萄糖 2.5g 蛋白胨1.25g ； KH2PO4·3H2O 0.25g; MgSO4·7H2O 0.125g; 0.1％孟加拉红溶液 0.83ml; 琼脂 3.8～5g; 蒸馏水 250ml; 自然pH; 用量： 250mL/行；制备12个平板；2个/人〔涂布/划线〕 制作斜面：无需抗生素 配制方法
实验二
微生物培养基的配制和灭菌
微生物培养基的配制和灭菌
目的要求 实验材料 实验程序
目的要求
了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌
法的原理及其使用方法。 熟悉别离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。
实验材料
药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可 溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O
实验程序1:培养基的配制
培养基 培养基的配制原那么 培养基的种类 培养基的配制方法和步骤 培养基的配方及配制 无菌水的制备
培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。它是进展科学研究，发酵生产微生物制 品等的根底 。
培养基的配制原那么
一、营养成分 二、PH值 三、渗透压 四、氧化复原电位
等。
高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀 菌灯。
其它：天平、牛角匙、电炉、2MHCl、2MNaOH、pH试纸、 刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角 瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、 各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。
实验程序
培养基的配制 别离培养微生物常用器皿的准备 培养基和玻璃器材的灭菌方法
营养成分
碳源 氮源 矿物质 生长因子 水分
培养基的配制原那么
培养基的配制原那么
碳源〔carbon source〕但凡提供微生物营养所需 的碳元素〔碳架〕的营养源，称为碳源。
碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整 个生理活动所需要的能量〔异养微生物〕。
微生物的碳源谱 无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。 有机含碳化合物：糖与糖的衍生物、脂类、醇类。 有机酸、烃类、芳香族化合物以及各种含氮的化合 物。