TLR-4、TNF-α和IL-1在急性肺损伤中的表达及意义

TLR-4、TNF-α和IL-1在急性肺损伤中的表达及意义
王蔚琛;石磊;刘巍;蔡虹静;夏永富
【摘要】目的研究急性肺损伤大鼠Toll样受体4(TLR-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-1(IL-1)表达变化的临床意义.方法 40只Wistar大鼠随机分为假手术组与模型组, 假手术组采用仅无菌开腹与盲肠翻动, 模型组采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制作急性肺损伤模型,分别于假手术及CLP术后6、12 h处死大鼠,ELISA 检测血清中TNF-α和IL-1的水平,免疫组织化学法检测TLR-4和TNF-α在大鼠肺组织中的表达分布.结果模型组在两个时间点中血清TNF-α和IL-1水平均高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.01);且CLP 12 h组在血清中TNF-α和IL-1水平显著高于CLP 6 h组,差异有统计学意义(P<0.01);TLR-4和TNF-α在模型组两个时间点中肺组织中表达均增强,TLR-4 在肺巨噬细胞及血管内皮细胞表达,TNF-α主要分布在气道上皮细胞和巨噬样细胞表达.结论 TLR-4、TNF-α和IL-1水平可作为早期诊断急性肺损伤的指标.
【期刊名称】《滨州医学院学报》
【年(卷),期】2017(040)004
【总页数】4页(P241-243,248)
【关键词】急性肺损伤;TLR-4;IL-1;TNF-α;盲肠结扎穿孔术
【作者】王蔚琛;石磊;刘巍;蔡虹静;夏永富
【作者单位】滨州医学院附属医院中心实验室滨州 256603;滨州医学院病理生理学教研室;滨州医学院病理生理学教研室;滨州医学院病理生理学教研室;滨州医学院附属医院呼吸内科
【正文语种】中文
【中图分类】R563.8
急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是临床常见的严重综合征，是各种直接和间
接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全。

其发作快，进展迅猛，愈后差。

ALI可由脓毒症和非脓毒症即感染性和非感染性因素引起,其中脓毒症是一种感染引起的
全身炎性综合征。

脓毒血症病死率逐年呈上升趋势，到目前为止脓毒症仍是导致重症患者死亡的高危因素之一[1]。

脓毒症病例出现ALI者在病程中历经细菌和内毒
素激活炎症反应，肺组织细胞膜离子转换酶受损，以及随之引起的细胞内水肿[2]，病理表现为肺部大量炎性细胞的浸润及肺水肿的形成。

Toll 样受体(TLRs) 是近些年发现的一类固有免疫受体, 属于模式识别受体。

它可对病原体相关分子模式进行识别,介导固有免疫的跨膜信号转导[3],从而激活多种促炎因子如白介素-lβ(interleukin，IL-lβ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、IL-6，参与抗感染的炎症过程。

而TLR4是TLRs家族重要成员，也是研究热点之一[4]。

本实验通过盲肠结扎穿孔术(cecal ligationand puncture,CLP)诱导脓毒血症从而
出现ALI，检测血清中炎症因子IL-1和TNF-α的表达，并检测TLR-4和TNF-α
在肺组织中的表达情况，探讨它们在ALI中的作用和意义。

1.1 试剂大鼠IL-1、TNF-α检测ELISA试剂盒；浓缩型TLR-4和TNF兔抗鼠多
克隆抗体以及DAB显色试剂盒均购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验分组健康清洁级成年雄性Wistar大鼠30只(烟台绿叶公司实验动物中心提供)，随机分为假手术组10只，模型组20只。

模型组采用CLP诱导脓毒血症制备鼠ALI模型，所有大鼠均适应性饲养5 d后用于实验。

实验前12 h禁食, 自由
饮水。

1.3 方法
1.3.1 模型制备过程参照Ozturk等[5] 的方法并改良如下，3%戊巴比妥钠行腹腔麻醉，沿腹白线中段做一长1.5 cm的切口，分离盲肠，在距盲肠末端1 cm处用丝线结扎盲肠，避免结扎盲肠动脉及引起肠梗阻，用穿刺针在盲肠肠系膜对面贯穿3次，针孔间距约3 mm，挤出少许内容物，还纳肠管。

术毕关腹，于腹壁皮下注射生理盐水30 mL/kg抗休克处理。

术后自由进食饮水。

假手术组仅做无菌开腹与盲肠翻动。

1.3.2 标本收集及处理假手术及CLP术后6 h和12 h每组10只，3%戊巴比妥钠麻醉后，心脏取血，高速离心后取上清备用测定IL-1和TNF-α，从胸腔取出肺组织后4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，免疫组化测定TLR-4和TNF-α在肺组织的中的表达情况。

1.4 统计学处理血清IL-1和TNF-α、肺组织TLR-4和TNF-α表达均以均数±标准差表示, 并进行两样本t检验比较。

数据采用SPSS11.0统计软件处理。

2.1 血清TNF-α、IL-1变化情况(表1) CLP 6 h组、CLP 12 h组血清中TNF-α的水平显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.01)，CLP 6 h组、CLP 12 h组血清中IL-1的水平显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.01)，CLP 12 h组在血清中TNF-α和IL-1水平显著高于CLP 6 h组，差异有统计学意义(P<0.01),见表1。

2.2 TLR-4和TNF-α在肺组织各组免疫组化累计光密度结果(表2) 应用计算机图象分析软件对免疫组化染色各组切片进行400倍图像采集，每张切片随机采5个视野，使用计算机图象分析软件计算累计光密度值，对各组免疫组化染色进行半定量分析。

TLR-4和TNF-α在各组肺组织中均有表达，其中CLP 6 h组、CLP 12 h 组表达明显均高于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.01)；CLP 12 h组肺组织
TNF-α和IL-1累计光密度水平显著高于CLP 6 h组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 TLR-4和TNF-α在肺组织中表达情况假手术组间质无明显增厚，CLP 6 h组
部分肺泡间隔增厚，CLP 12 h组肺组织结构明显破坏，TLR-4 在肺巨噬细胞及血
管内皮细胞均有表达，在胞膜呈现橙黄色颗粒(图1)。

TNF-α主要分布在气道上皮细胞和巨噬样细胞，在胞膜呈现橙黄色颗粒，部分细胞胞浆也有黄色颗粒(图2)。

实验采用CLP术由肠源性感染诱发脓毒血症致ALI能较好的模拟疾病发生的病理
生理学过程[6]。

ALI临床上以顽固性的低氧血症和呼吸窘迫为主要表现，其致病
机理目前尚未完全阐明，炎症反应失控是其发病的重要原因。

研究主要集中在炎性细胞活性，炎性介质的产生、释放，机械、化学因素，肺泡屏障损伤等多方面。

TNF-α主要是由活化的单核巨噬细胞产生，也可产生于成纤维细胞、星形胶质细胞、肿瘤细胞等[7]，有促进炎症反应和间质细胞增殖分化的作用，并可通过与其
他细胞因子的相互作用，在某种程度上直接或间接促进细胞外基质( extra cellular matrix，ECM) 的合成。

TNF-α是体内多种细胞因子调节网络的启动因子，在正
常组织炎症的发生、发展过程中发挥极其重要的作用[8]。

刘其文等[9]研究发现放
射性肺损伤大鼠血清TNF-α水平呈抛物线形态，即从放疗后第1周开始，TNF-α由正常水平迅速升高，第5周达到峰值，随后迅速下降，实验表明，在损伤早期TNF-α水平迅速升高，与炎症反应呈正相关。

汪海慧[10]等研究发现采用CLP制
备脓毒症ALI模型后，模型组大鼠血清TNF-α、IL-10 含量较假手术组明显增高(P<0.01)，且抗炎合剂组含量明显降低，实验表明，抗炎合剂可达减少炎症因子
释放，从而有效减轻大鼠的肺损伤程度。

革兰阴性菌及其LPS是脓毒症所致ARDS的主要因素。

研究已证明LPS能与LPS 结合蛋白(LBP)结合成为复合体，迅速刺激体内单核巨噬细胞，使LPS与CD14的亲和力增高数百倍，并且分泌大量炎性介质，造成机体损害。

LPS也可与调理素受
体(CD14)结合，然后再与细胞膜TLRs结合启动细胞内信号转导[11]。

其中TLR4 属于TLRs 家族中最重要的模式识别受体之一，可在各种上皮细胞、内皮细胞和免疫相关细胞(如单核巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、T淋巴细胞和B淋巴细
胞等)中广泛表达[12]。

通过激活TLR4 信号通路，可促进单核巨噬细胞分泌IL-1、IL-12、TNF-α等炎症因子和其他细胞因子。

黄继义[13]等研究发现阻断 TLR-4表达能抑制脂多糖诱导 ALI 大鼠体内炎症因子分泌，减轻肺组织病理损害，能达到
治疗ALI 的作用。

本研究发现，在CLP 6 h组、CLP 12 h组血清中IL-1、TNF-α的水平显著高于假手术组，且CLP 12 h组在血清中TNF-α和IL-1水平显著高于CLP 6 h组，表示这两个因子参与了急性呼吸窘迫综合征的进程。

且在CLP 12 h组明显增高，说明瀑布级联式炎症反应导致大量细胞因子释放，这些细胞因子使得局部炎症反应增强，导致肺损伤的发生。

本研究还发现，假手术组间质无明显增厚，CLP 6 h组部分肺泡间隔增厚，CLP
12 h组肺组织结构明显破坏，TLR-4 在肺巨噬细胞及血管内皮细胞均有表达。

TNF-α主要分布在气道上皮细胞和巨噬样细胞。

TLR-4与TNF-α表达分布情况呈一致趋势，由此推测在机体发生感染时，TLR-4可能作为上游因子，诱导TNF-α
和IL-1的大量释放，促使中性粒细胞和巨噬细胞进一步激活，另外也观察到在中
性粒细胞和巨噬细胞有TNF-α和IL-1的表达。

由此推测，革兰阴性菌及其LPS
引起的脓毒血症中，确实激活TLR-4介导的免疫应答，引起其下游因子TNF-α和IL-1的大量释放有关。

本研究认为革兰阴性菌及其LPS引起的脓毒血症中外周血TNF-α和IL-1水平的
检测可作为早期判断肺损伤的指标，而近年来，TLRs，尤其是TLR-4介导的炎症
递质的释放在研究中越来越受到重视，新型合成TLR拮抗剂可能会在不久的将来
更好的应用于临床，降低严重脓毒症患者的死亡率，期望通过实验进一步明确
TOLL样受体在急性肺损伤的中的作用，为临床治疗提供科学资料。

【相关文献】
[1] Moran J L,Graham P L,Roekliff S,et al.Updating the evidence for the role of corticosteroids in severe sepsis and septic shock：a Bayesian meta-analytic
perspective[J].Critical Care,2010,14(4)：R134.
[2] Zhao X,Dib M,Andersson E,et al.Alterations of adhesion molecule expression and inflammatory mediators in acute lung injury induced by septic and non-septic challenges[J].Lung,2005,183(2):87-100.
[3] Zhao Z Q,Corvera J S,Halkos M E,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol,2003,285(2):579-588.
[4] Choi J P,Kim Y S,Kim O Y,et al.TNF-alpha is a key mediator in the development of The cell response to inhaled allergens induced by a viral PAMP double-stranded
RNA[J].Allergy,2012,67(9):1138-1148.
[5] Ozturk E, Demirbilek S,Bege Z,et al.Does leflunomide attenuate the sepsis-induced acute lung injury?[J].Pediatr SurgInt,2008,24(8):899-905.
[6] 齐志江,王晓芝.Tie-2在鼠急性肺损伤中的表达及意义[J].滨州医学院学报,2009,32(2):97-99.
[7] Szlosarek P,Charles K A,Balkwill F R.Tumour necrosis factor-α as a tumour
promoter[J].Eur J Cancer,2006,42(6):745-750.
[8] Rübe C E,Wilfert F,Palm J,et al.Irradia tion induces a biphasic expression of pro-inflammatory cytokines in the lung[J]．Strahlenther Onkol,2004,180( 7):442-448.
[9] 刘文其,袁堃,范小玲,等.放射性肺损伤大鼠血清TNF-α水平变化及意义[J].山东医
药,2013,53(28):28-30.
[10] 汪海慧,闫国良,熊旭东.抗炎合剂对脓毒症急性肺损伤大鼠血清可溶性CD80、CD86、TNF-α、IL-10 水平的影响[J].中国中医急症,2016,25(6)：981-984.
[11] Krishnan J,Selvarajoo K,Tsuchiya M,et a1.Toll-like receptor signal transduction[J].Exp Mol Med,2007,39(4)：421-438．
[12] He Z,Gao Y,Deng Y,et al.Lipopolysaccharide induces lung fibroblast proliferation through Toll-like receptor 4 signaling and the phosphoinositide3-kinase-Akt
pathway[J].PloS One,2012,7(4):e35926.
[13] 黄继义,刘才文,林建东,等.TOLL 样受体4对脂多糖致急性肺损伤大鼠炎症因子的影响[J].西南
国防医药,2014,24(1):23-26.。