人胰岛素的制备

⼈胰岛素的制备
⼈胰岛素得制备
⼀、获得⽬得基因
从供体细胞中提取mRNA,以其为模板,在反转录酶得作⽤下,反转录合成胰岛素mRNA互补DNA,再以cDNA第⼀链为模板,在反转录酶或DNA聚合酶I得作⽤在,最终合成编码它得双链DNA序列。

即得到了⽬得基因。

反转录-聚合酶链反应法
(⼀)从⼈体细胞内提取胰岛素基因转录得mRNA
1, 细胞总RNA得提取 :
取胰岛B细胞,⽤PBS洗后,加⼊TRIZOL试将细胞破裂,后⽤DEPC处理,多次离⼼后,取RNA⽩⾊沉淀,测OD值,电泳。

2 ,从总RNA中分离mRNA:
取上述提取得总RNA若⼲,加⼊Buffer OBB ,Oligotex Suspension ,打匀。

70℃⽔浴(裂解RNA得⼆级结构), 20-30℃条件下,静置(让Oligotex与mRNA结合)。

将Oligotex/mRNA复合物得沉淀加到EP管SPIN柱上⾼速离⼼,加Buffer 将其她RNA洗脱,最后⽤琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。

(⼆)mRNA转录合成cDNA第⼀链
cone 第⼀链得合成
加⼊上步获得得mRNA与适当引物于EP管中,加⼊RNase-free water,混匀后,70℃反应10分钟,反应完成后,⽴刻将反应体系置于冰上5min;稍微离⼼⼀下,顺序加⼊缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP(加⼊放射性同位素利于检验), 混匀,稍微离⼼反应物之后,42℃放置2分钟。

取出置于冰上。

电泳分析,
同位素活性测定。

(三)PCR法扩增,特异合成⽬得cDNA链
通过胰岛素得特异引物,⽤PCR法进⾏扩增,特异得合成胰岛素得cDNA 链。

PCR法得操作步骤:
预变性
引物退⽕
引物延伸
循环25-35次
最后延伸
前端引物:
5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac
cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’
后端引物:
5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’
⼆、组建重组质粒
采⽤pQE--30质粒作为载体,⽤双酶切法进⾏基因重组。

１、双酶切法
⽤两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA与外源DNA⽚段,使载体与外源⽬得基因得两端分别形成不同黏性末端,将它们混合,在连接酶得作⽤下相同得黏性末端可退⽕连接成重组DNA分⼦,从⽽实现DNA得定向连接。

２、重组过程
pQE--30⽤Hind Ⅲ与BamHⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切⽚段。

外源DNA⽚段同样也⽤Hind Ⅲ与BamHⅠ酶切并回收纯化酶切⽚段。

双酶切后得载体外源DNA⽚段混合退⽕,因为Hind Ⅲ与BamHⅠ得黏性末端不匹配,避免了载体与外源DNA⽚段得⾃⾝连接,外源DNA⽚段只能定向地连接到载体得Hind Ⅲ与BamHⅠ位点之间。

当然也不可避免发⽣载体得Hind Ⅲ与BamHⅠ得黏性末端之间得两个碱基互补形成开环,转到⼤肠杆菌中被修复,但这样得重组⼦占少数,就是低效转化。

三、构建基因⼯程菌
(⼀)重组⼈胰岛素得⼤肠杆菌⼯程菌得构建
A链与B链同时表达法
将⼈胰岛素得A链与B链编码序列拼接在⼀起,然后组装在⼤肠杆菌-半乳糖苷酶基因得下游。

重组⼦表达出得融合蛋⽩经CNBr 处理后,分离纯化A-B链多肽,然后再根据两条链连接处得氨基酸残基性质,采⽤相应得裂解⽅法获得A链与B 链肽段,最终通过体外化学折叠制备具有活性得重组⼈胰岛素。

重组DNA得转化
1, CaCl2法制备⼤肠杆菌感受态细胞:
取100 ml 菌体培养⾄OD600 = 0、5,离⼼收集菌体,⽤10 ml 冰冷得10 mM CaCl2溶液悬浮菌体,离⼼,收集菌体,⽤1 ml 冰冷得75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 ,冰浴放置12 - 24⼩时,备⽤。

2,⼤肠杆菌感受态细胞得质粒转化:
取100 ml 感受态细胞,加⼊相当于50 ng 载体得重组,DNA连接液,混匀。

冰浴放置半⼩时。

在42 ℃保温 2 分钟(热脉冲),快速将转化细胞转移⾄冰浴中放置1 – 2 分钟。

加⼊1 ml 新鲜培养基,于37 ℃培养 1 ⼩时(扩增) 。

涂在合适得固体培养基平板上进⾏筛选。

经典得CaCl2转化⽅法:
a将培养液转⼊离⼼管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离⼼10分钟。

b 弃去上清,⽤预冷得0、05mol/L得CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离⼼10分钟。

c弃去上清,加⼊4ml预冷含15%⽢油得0、05mol/L得CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置⼏分钟,即成感受态细胞悬液。

d 感受态细胞分装成200µl得⼩份, 贮存于-70℃。

e从-70℃冰箱中取200µl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后⽴即置冰上。

f 加⼊pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10µl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。

g42℃⽔浴中热击90秒或37℃⽔浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

h向管中加⼊1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1⼩时,使细菌恢复正常⽣长状态,并表达质粒编码得抗⽣素抗性基因(Ampr )。

i将上述菌液摇匀后取100µl 涂布于含Amp得筛选平板上,正⾯向上放置半⼩时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养⽫,37℃培养16-24⼩时。

(⼆)重组⼦得筛选与鉴定(载体遗传标记检测)
1、初筛选
随机挑取转化单菌落,在LB／AK培养基(含100p g／ml氨苄青霉素与50ug/ml 卡那霉素)中进⾏培养,⽤O、5mmol／LIPTG诱导表达。

表达情况⽤16.5％SDS.PAGE进⾏分析。

2、重组菌得后续鉴定
直接电泳检测法
将初筛选获得得重组菌扩⼤培养后,提取其质粒DNA,通过PCR对其进⾏扩增,利⽤有插⼊⽚段得重组载体得分⼦量⽐野⽣型载体分⼦量⼤,⽤电泳法检测质粒就是否为重组质粒。

⽬得蛋⽩表达检验
所得菌体经溶菌酶／超声破碎细胞后得到得包涵体进⾏SDS—PAGE分析,所需基因⼯程菌表达得外源蛋(His)6·Arg-Arg-⼈胰岛素原以包涵体形式存在,其分⼦⼤⼩约为13kb,经电泳与胰岛素原marker对⽐,如条带显⽰有所需⽬得蛋⽩,则所得菌既可做⼯程菌使⽤,经扩⼤培养后,斜⾯保存以便后续使⽤。

3、⼯程菌得保藏
15%⽢油保存菌种,菌液=20:80,,充分混匀后,-70度保藏。

四、培养⼯程菌
优化发酵条件
采⽤⽐浊法测定不同时间培养基中菌量,
绘制基因⼯程菌得⽣长曲线,在摇瓶培
养得⽔平下,采⽤优化得发酵培养基发酵基因⼯菌,培养4⼩时候即进⼊对数⽣长期,⽽且对数⽣长期可延长⾄17⼩时。

1,正交优化实验:
采⽤正交法,选取摇瓶培养条件中七个主要因素进⾏两⽔平正交优化,该七个因素为:种⼦活化⽅式,摇床转速(通风量),IPTG诱导温度,接种量,IPTG添加量,诱导时间,补料⽅式。

分别⽤A、B、C、D、E、F、G表⽰.以每升培养基收获湿菌体得量及发酵液得A600为⽬标量,考察条件优化得效果,进⾏⼋次实验,对实验结果进⾏分析,优化出最佳实验条件。

2,其她条件优化:
在优化发酵条件得基础上,进⼀步就各种⾦属元素对苗体⽣长发重
组蛋⽩诱导得影响作了分析。

3,放⼤培养(⽐较不同发酵⼯艺产量):
在优化摇瓶⽔平发酵试验得基础上,放⼤⾄1 L培养基中⽐较两种
发酵⼯艺。

在不同转速,通⽓量,pH条件下,⽐较选择产量最⾼得发酵⼯艺。

五、产物分离纯化
由于基因⼯程药物就是从转化细胞、⽽不就是从正常细胞⽣产得,所以对产品得纯度要求也要⾼于传统产品。

基因⼯程药物得分离纯化⼀般不应超过4-5个步骤,包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、⾼度纯化直⾄得到纯品以及成品加⼯。

发酵液进⾏细胞分离,分别得到胞内产物与胞外产物。

胞外产物直接进⾏透析浓缩然后进⾏再复性及酶转化,再对产物进⾏⾼度纯化,最后制剂即可。

胞内产物⽤溶酶菌或超声波将细胞破碎,细胞破碎后⽤⾼速离⼼法进⾏固液分离。

分离后⽤变性剂或者离⼦去污剂得到包含体,再⽤变性剂(尿素)使其变形,接着⽤⼆次复性法将其复性。

对复性后得产物进⾏透析浓缩,然后进⾏再复性及酶转化,再对产物进⾏⾼度纯化,最后制剂即可。

重组蛋⽩分离纯化得特点
重组蛋⽩质分离纯化得特点为:(1)⼤多数重组蛋⽩质产品就是⽣物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离⼦强度得变化均可使蛋⽩质变性失活a(2)重组蛋⽩质产品在物料中含量很低,凰物料组成⾮常复杂。

例如,利⽤基因⼯襁菌发酵⽣产蛋⽩藤,物料中含有⼤量缀成复杂得培养基、荣体⽣产代谢物等,疆拣蛋鑫囊魏含量嚣豢不瑟蛋鑫凄慈爨鹃1％。

舂些嚣拣鬣囊矮存在予缀懿武或在胞内形成包含体,为获敬蛋⽩质,还需避⾏细脆破碎,结鬈物料中含有⼤量得细胞碎⽚与胞内产物。

(3)含蛋⽩质产晶得物料不稳定,蛋⽩质产品易受料液中蛋⾃⽔解酶降解。

(4)很多熏组蛋⽩质产品作为医药、⾷品被⼈炎利⽤,因⽽要求蛋国艨产器必绥就是裹癀缝铯瓣,产蘸⽆萤、兹致热源等。

与传统麓⽣物⼤分⼦分离⽅式楣镄,蘩缀蛋⾅得分离纯纯恣憝秘⽤其携理稻化学性质得差异,即以分⼦得⼤⼩、形状、溶解度、等电点、祭疏⽔性以及与其它分⼦得亲与性等性质建⽴起来得。

⼆次复性法:
0.5g包涵体溶解于⼀定量得缓冲液B(50mmol／LGly—NaOH,8 mol／L尿素,B_巯基⼄醇,pH 9.5)中,使之充分混悬,静置1⼩时以上。

混悬液分步逐滴加⼊到缓冲液C(50mmol／LGly-NaOH,半胱氨酸⼀胱氨酸,pH 9.5)中,4℃静置复性过夜。

上样于已⽤
50mmol／LGly—NaOH(pH 9.5)平衡得DEAE-Sepharose FF柱,⽤0.1mol／L得氯化钠梯度洗脱,通过SDS-PAGE确定RRhPI位置,⽤DEAE-Sepharose FF做离⼦交换层析,收集含RRhPI得洗脱峰2,层析图谱见(图6)。

电泳检测显⽰(图11)峰2主要为RRhPI,及少量⾼分⼦杂质,收集峰2做再复性。

峰1为pH⾼于9.5及⼀些疏⽔性蛋⽩质形成得穿透峰,绝⼤部分pH低于RRhPI得蛋⽩质与
核酸类杂质则牢固地结合在柱⼦上,在较⾼盐浓度及2mol／L NaCl得条件下被洗脱下来,形成其她峰3与峰4。

胰岛素原(RRhPI)得再复性及酶切转化:
1,复性
将初步复性及纯化后得RRhPI通过透析浓缩,先后转换到缓冲液B与D(50mmol／L G1y-NaOH,氧化型⾕胱⽢肽(GSSG)⼀还原型⾕胱⽢(GSH)pH9.5)中,使蛋⽩浓度为0.1～O.6 mg／ml,4℃静置过夜。

2,酶切
复性后得RRhPI复性液调节pH后加⼊⼀定量得胰蛋⽩酶(trypsin)
与羧肽酶B(carboxypeptidase B)在37。

C进⾏协同酶切⼀段时间,然
后滴加2 mol／L ZnCI:⾄ZnCl:浓度为0.1mol／L终⽌反应并沉淀⽣成得
hI,⽤双蒸⽔洗涤沉淀得较纯B9重组⼈胰岛素约79 mg/L培养基。

重组胰岛素粗品得纯化:
胰岛素粗品⽤0.2 mol／L NaAc·HAc,pH4.0溶解。

溶解后得样品通过
Superdex 75进⾏纯化(图10),得1、2、3峰,收集峰3,透析后冻⼲即
为胰岛素产品所得胰岛素产品⽤SDS-PAGE分析为单带,电泳检测见图。

六、除菌过滤
传统过滤只能滤去空⽓中得尘埃、液体中得异物微粒,很难去除微⽣物活体(细菌、病毒及热原体);薄膜过滤就是微孔筛分,⼤于孔径得微粒均被截留,微⽣物粒⼦⼤⼩为0、5-2微⽶,只要选⽤0、45微⽶得微孔滤膜即可将微⽣物截留去除,⽤0、22微⽶得微孔滤膜则可能将病毒、热原体去除。

注射⽤药液除⽤传统过滤器去除药液中得异物外,现已采⽤微孔滤膜将澄清得药液再次除菌、除热原,其滤膜孔径最好在0、22微⽶以下。

制药空⽓得过滤亦因GMP得不同级别要求⽽采⽤相应得器材、过滤器。

要指出得就是,制药⽆菌空⽓得供应仅采⽤传统滤材、滤器往往不能达到要求,其终端必须选⽤微孔薄膜,孔径必须在0。

45微⽶以下。

注射⽤⽆菌药液得处理:按GMP要求,注射⽤药液应当⽆菌⽆热原,本品药液配制好后,经过粗砂棒、细砂棒( 适当使⽤滑⽯粉或碳粉)过滤成澄明液后,再经过0、45微⽶多层微孔滤芯除菌,终端通过0、22微⽶单层超微孔滤膜后上机灌装。

⽬前,⽤于过滤器常⽤得主要过滤材料⼤致有以下⼏种:
混合纤维素酯
常⽤来制成圆形得单⽚平板滤膜,⽤于液体与⽓体得精过滤;聚丙烯(PP)
做成折叠式,常⽤于筒式过滤器,有较⼤得孔径,其具有亲⽔性,属粗过滤材料;
聚偏⼆氟⼄烯(PVDF)
属精过滤材料,耐热与耐化学稳定,蒸汽灭菌承受性良好,可制成亲⽔性滤膜,较⼴泛应⽤于制药⼯业⽆菌制剂⽤⽔及注射⽤⽔得过滤;
聚醚砜(PES)
做成折叠式,常⽤于筒式过滤器,耐温耐⽔解性能好,亲⽔性材料,⽤于精度较⾼得溶液得精过滤;
尼龙
做成折叠式,常⽤于筒式过滤器,亲⽔性材料,常⽤作液体得精过滤;
聚四氟⼄烯(PTFE)
做成折叠式,常⽤于筒式过滤器,疏⽔性材料,其就是使⽤相当⼴泛得⼀种材料,耐热耐化学稳定,常⽤于⽔、⽆机溶剂及空⽓得精
过滤。

除菌过滤器得特点
(1)除菌过滤器⼀般采⽤⼗字悬挂式,⽔平进出。

多芯过滤器可设计成落地式。

(2)有些使⽤场合根据实际需要分成预过滤器、精过滤器两种。

(3)空⽓流向:从外向内穿过滤芯。

(4)进⼊除菌过滤器得压缩空⽓必须先经过⾄少三级得精密过滤器及⼲燥机。

除油、除⽔、除尘,油雾浓度应≤0、01PPM,否则将影响除菌滤芯得寿命,达不到预期得除菌效果。

(5)定期杀菌,根据实际使⽤情况每周或每⽉1~2次,每次30分钟,采⽤经过1µ过滤精度得洁净饱与蒸汽杀菌。

蒸汽温度＜140℃,蒸汽压⼒＜0、3MPa。

阀门缓慢开关。

(6)作为罐体、设备得呼吸器使⽤时,其作⽤主要在于连通⼤⽓防⽌设备内部负压与隔离开空⽓中得污染源,过滤⽅⾯得功能不⼤,因此在过滤上基本⽆要求。

对胰岛素进⾏除菌过滤后采⽤胰岛素冻⼲粉等冻⼲技术冻⼲,既得胰岛素结晶。

经包装等⼯序后得成品。

如下图:
七、半成品检定
重组⼈胰岛素半成品检测(检测提取纯化后重组⼈胰岛素样品):
(⼀)杂质检定
1,有关物质 : 取本品适量,⽤0、01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含3、5mg得溶液,作为供试品溶液。

取供试品溶液20µl注⼊液相⾊谱仪,记录⾊谱图,按⾯积归⼀化法计算,含A21脱酰胺⼈胰岛素不得过1、5%,其她有关物质总量不得过2、0%。

2,⾼分⼦蛋⽩质 :取本品适量,⽤0、01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含4mg得溶液,作为供试品溶液。

按照分⼦排阻⾊谱法试验。

以⾊谱⽤亲⽔改性硅胶为填充剂(5～10µm);冰醋酸-⼄腈-0、1%精氨酸溶液(15:20:65)为流动相,流速为每分钟0、5ml,检测波长为276nm。

取重组⼈胰岛素单体-⼆聚体对照品,⽤0、01mol/L 盐酸溶液制成每1ml中含4mg得溶液;取100µl注⼊液相⾊谱仪,重组⼈胰岛素单体与⼆聚体得分离度应符合要求。

取供试品溶液100µl,注⼊液相⾊谱仪,记录⾊谱图,除去保留时间⼤于⼈胰岛素主峰得其它峰⾯积,保留时间⼩于⼈胰岛素主峰得所有峰⾯积之与不得过1、0%。

3,锌 :对照品溶液得制备精密量取锌标准溶液(1000µg/ml)5ml,置100ml量瓶中,加0、01mol/L盐酸溶液⾄刻度,摇匀。

供试品溶液得制备精密称取本品适量,⽤0、01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含锌约0、4~0、8µg得溶液,摇匀。

测定法精密量取对照品溶液,⽤0、01mol/L盐酸溶液分别稀释成每1ml锌含量为0、20µg、0、40µg、0、60µg、0、80µg、1、00µg得溶液。

将上述各溶液与供试品溶液,照原⼦吸收分光光度法,在213、9nm得波长处测定,按⼲燥品计,含锌量不得过1、0%。

4,炽灼残渣 :取本品约0.2g,依法检查,遗留残渣不得过2、0%。

(⼆)效价测定:按照⾼效液相⾊谱法测定
取本品适量,精密称定,⽤0、01mol/L盐酸溶液定量稀释⾄每1ml中约含10单位得溶液(临⽤新配)。

精密量取20 l注⼊液相⾊谱仪,记录⾊谱图;另取重组⼈胰岛素对照品适量,同法测定。

按外标法以⼈胰岛素峰⾯积(包括A21脱酰胺峰⾯积)计算,即得。

(三)胰岛素⽣物测定法
本法系⽐较胰岛素标准品(S)与供试品(T)引起⼩⿏⾎糖下降得作⽤,以测定供试品得效价。

标准品溶液得制备:精密称取胰岛素标准品适量,按标⽰效价,加⼊每100ml中含有苯酚0、2g并⽤盐酸调节pH值为2、5得0、9%氯化钠溶液,使溶解成每1ml 中含20单位得容易忘,4~8℃贮存,以不超过5天为宜。

, 标准品稀释液得制备试验当⽇,精密量取标准品溶液适量,按⾼低剂量组(ds
2
ds
})加0、 9氯化钠溶液(pH2、 5)制成两种浓度得稀释液,⾼低剂量得⽐值(r) 1
不得⼤于1:0、 5。

⾼浓度稀释液⼀般可制成每1 ml中含0、 06^'0、 12单位,调节剂量使低剂量能引起⾎糖明显下降,⾼剂量不致差别。

供试品溶液与稀释液得制备按供试品得标⽰量或估计效价(A
),照标准品
T
溶液与其稀释液得制备法制成⾼、低两种浓度得稀释液,其⽐值(r)应与标准品相等,供试品与标准品⾼低剂量所致得反应平均值应相近。

测定法取健康合格、同⼀来源、同⼀性别、出⽣⽇期相近得成年⼩⿏,体重相差不得超过3g,按体重随机等分成4组,每组不少于10只,逐只编号,各组⼩⿏分别⾃⽪下注⼈⼀种浓度得标准品或供试品稀释液,每⿏0、 2 ^0、 3ml,但各⿏得注射体积(ml)应相等。

注射后40分钟,按给药顺序分别⾃眼静脉丛采⾎,⽤适宜得⽅法,如葡萄糖氧化酶⼀过氧化酶法测定⾎糖值。

第⼀次给药后间隔⾄少3⼩时,按双交叉设计,对每组得各⿏进⾏第⼆次给药,并测定给药后40分钟得⾎糖值。

照⽣物检定统计法(附录XlV)中量反应平⾏线测定双交叉设计法计算效价及实验误差。

本法得可信限率(FL%)不得⼤于25 %
(四)注射液检测
1,渗透压摩尔浓度: 除另有规定外,静脉输液及椎管注射⽤注射液按各品种项下得规定,照渗透压摩尔浓度测定法检查,应符合规定。

2,可见异物: 除另有规定外,照可见异物检查法检查,应符合规定。

3,不溶性微粒 :除另有规定外,溶液型静脉⽤注射液、注射⽤⽆菌粉末及注射⽤浓溶液照不溶性微粒检查法检查,均应符合规定。

3,⽆菌: 按照⽆菌检查法检查,应符合规定。

4,细菌内毒素或热原: 除另有规定外,静脉⽤注射剂按各品种项下得规定,照细菌内毒素检查法或热原检查法检查,应符合规定。

热原(pyrogen)
1、热原得定义 : 注射后能引起⼈体特殊致热反应得物质。

2、热原得组成 : 热原就是微⽣物得代谢产物,就是微⽣物得⼀种内毒素,⼤多数细菌都能产⽣热原,⾰兰⽒阴性杆菌致热⼒最强。

热原由磷脂、脂多糖与蛋⽩质所组成得复合物,其中脂多糖就是致热活性中⼼。

脂多糖组成因菌种得不同⽽异,热原得分⼦量106左右。

3、热原得危害 : 含热原得注射剂输⼊⼈体后,约半⼩时⼈体就发冷、寒战、体温升⾼、全⾝痛、出汗、恶⼼呕吐等,严重时⾼烧40度、昏迷、虚脱、甚⾄死亡。

⼋、成品检定
重组⼈胰岛素成品检测(即检测重组⼈胰岛素注射液样品):
本品为重组⼈胰岛素得⽆菌⽔溶液。

其效价应为标⽰量得90、0％～110、％。

本品可加⼊适量得苯酚或间甲酚作抑菌剂。

【鉴别】
(1) 取本品,按照重组⼈胰岛素项下得鉴别项试验,显相同得结果。

(2)在苯酚或间甲酚检查项下记录得⾊谱图中,供试品溶液中苯酚峰或间甲酚峰得保留时间应与苯酚或间甲酚对照品得保留时间⼀致。

【检查】
1,有关物质取本品,每1ml中加9、6mol／L盐酸溶液3µl酸化,混匀后作为供试品溶液;取供试品溶液适量(约相当于⼈胰岛素2单位),按照重组⼈胰岛素项下得⽅法检查,扣除苯酚峰与间甲酚峰,按⾯积归⼀化法计算,A21脱酰胺⼈胰岛素不得过2、0%,其她有关物质总量不得过6、0%。

2,⾼分⼦蛋⽩质取本品,每1ml加9、6mol／L盐酸溶液3µL酸化,混匀后作为供试品溶液;取供试品溶液100µL,按照重组⼈胰岛素
项下⽅法检查,除去保留时间⼤于⼈胰岛素主峰得其它峰⾯积,保留时间⼩于⼈胰岛素主峰得所有峰⾯积之与不得过2、0%。

3,锌: 取本品适量,⽤0、01mol/L盐酸溶液制成每1ml含锌约0、4～0、8µg 得溶液作为供试品溶液,按照重组⼈胰岛素项下得⽅法检查,每100单位中含锌量应为10～40µg。

4,苯酚或间甲酚: 取苯酚或间甲酚(纯度≥99、5％),精密称定,⽤ 0、01mol／L 盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约含苯酚或间甲酚0、25mg得溶液,作为苯酚或间甲酚对照品溶液;精密量取本品适量,⽤0、01mol／L盐酸溶液定量稀释成每1ml约含苯酚或间甲酚0、25mg得溶液,作为供试品溶液。

按照重组⼈胰岛素效价测定项下⽅法检查,检测波长为270nm。

取重组⼈胰岛素对照品适量,⽤苯酚或间甲酚对照品溶液制成每1ml中含重组⼈胰岛素1mg得溶液,取20µl注⼊液相⾊
谱仪,苯酚峰、间甲酚峰与⼈胰岛素主峰得分离度应符合要求。

精密量取苯酚或间甲酚对照品溶液及供试品溶液各20µL,分别注⼊液相⾊谱仪,记录⾊谱图,按外标法以峰⾯积计算。

每1ml含苯酚或间甲酚应为2、00～2、75mg。

九、包装
⽣物制品包装规程
1、同⼀车间有数条包装⽣产线同时进⾏包装时,各包装线之间应有隔离设施。

外观相似得制品不得在相邻得包装线上包装。

每条包装线均应标明正在包装得药品名称、批号。

2、药品得内包装与外包装标签得内容、格式应符合国家药品监督管理部门得有关规定。

3、包装制品应在25℃以下进⾏。

有专门规定者应按各论执⾏。

4、瓶签要求贴牢,直接印字得制品要求字迹清楚,不易脱落或模糊,瓶签内容不得⽤粘贴、剪贴得⽅式进⾏修改或补充。

5、制品包装全部完成后,在未收到产品合格证前,应在待检区封存。

收到合格证后,⽅可填写⼊库单,交送成品库。

6、每个最⼩包装盒内均应附有药品说明书。

7、药品说明书应符合《中华⼈民共与国药品管理法》及国家药品监督管理部门对药品说明书得规定,并根据国家药品监督管理部门批准得内容编写。

⼩组成员:
沈迪、曾宇、屠⾔贝、张钰英、张寒光、温馨、谢丹、王亮杰、郭正兵、周明毅
查资料:全体制作:沈迪⽂稿:张钰英。