纤维素酶 ppt课件
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纤维素酶
纤维素酶的发酵
引言
• 纤维素是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合 物，绝大多数由绿色植物通过光合作用合成。据 估计，地球纤维素每年通过光合作用的更新量约 为4.0X 1010吨。
• 纤维素是地球上最丰富的多糖物质，是植物细胞 壁的主要组分，占植物秸秆干重的l／3～l／2，也 是自然界存在的最多的一类可再生生物聚合物。
纤维素酶理化特性
三：最适温度
• 酶反应存在一个最适温度。一般纤维素酶的最适 温度范围为40—60℃。纤维素酶各组分热稳定性 也存在差异，内切酶(Cx)的最适温度为50～60℃， 热稳定性好，在95℃时仍保留一般的酶活性；不 同来源的β—葡萄糖苷酶的最适温度均为50～60 ℃ 。然而有研究报道，β—葡萄糖苷酶具有很高 的耐温性，在50℃保温60h，仍保持95%以上的 活性，最适温度为70℃。也有报道，康宁木霉中 的外切酶(C1)具有特殊的热稳定性，其最适温度 为40～60℃。
纤维素酶的发酵工艺
一:固体发酵工艺
• 1 固体发酵工艺特点: 固体发酵法又称麸曲培养法，是
以秸秆粉、废纸、玉米秸秆粉为主要原料，拌入种曲 后．装入盘或帘子上，摊成薄层(厚约1 cm)，在培养室一 定温度和湿度(RH 90％一100％)下进行发酵。 • 其主要特点是发酵体系没有游离水存在，微生物是在有足 够湿度的固态底物上进行反应，发酵环境接近于自然状态 下的微生物生长习性，产生的酶系更全，有利于降解天然 纤维素，且投资低、能耗低、产量高、操作简易、回收率 高、无泡沫、需控参数少、环境污染小等。但固体发酵法 易被杂菌污染，生产的纤维素酶分离纯化较难．且色素不 易去除。
纤维素酶理化特性
一：分子量
• 不同来源、不同组分的纤维素酶分子量差别较大，其变化 范围很广。
• 目前普遍认为： ✓ 1.内切酶分子量介于23～146kDa；（但有研究认为）内
切酶相对分子量介于23～118kDa(胞内酶)和47～ 76kDa(胞外酶)。 ✓ 2.真菌EG的两种异构酶，EGI的分子量约为54kDaEGⅢ的 分子量约为49.8kDa。 ✓ 3.外切酶分子量介于38～118kDa，木霉属真菌产的CBH 1分子量约为66kDa，CBHII的分子量为53kDa；13—葡 萄糖苷酶为90～l00kDa(胞内酶型)和47～76kDa(胞外酶 型)。
• 2 .还原糖的测定 采用 3 ， 5 — 二硝基水杨 酸法( DNS法) ．
方法
• 3 .滤纸酶( FPase ) 活性测定：试管底部预 先放置适当大小的滤纸( 约 5 0 mg ) ， 加 入1mL样品与 1.5 mL柠檬酸一 Na 2 HP O4 缓冲液( 0. 2 mo l ／ L， p H5 . 0 )， 50℃ 保温 1 h，扣除本底,测定反应后还原糖的含 量． 酶活定义为上述条件下， 每小时催化 生成 lμg葡萄糖的酶量为一个 U ．
3生物工程来源：迄今，人们已从40多种细菌和数种 真菌中克隆 行改造，使其活性提高，耐受性增强。
培养基
• 选择培养基以羧甲基纤维素钠( CMC-Na) 取代查 氏培养基中的蔗糖， 其余配方不变；
• 种子培养基为 0.7 5 ％CMC - Na ,0 . 5 ％蛋白胨， 2％吐温 8 0， 0 .0 3 ％MgSO4 、 CaCl2 ， H2O， 微量 FeSO4 ,MnSO4 , ZnSO4 ,CoCI2 ， 自然 p H；
纤维素酶的发酵工艺
2 固体发酵设备浅盘发酵器
是比较常用的一种固态发酵设备，培养基经灭菌冷却后装入 浅盘，通过空气增湿器调节空间的温湿度进行发酵，工业 化程度较低。固体发酵设备发展的趋向是机械化发酵罐， 尤其是流化床式固体发酵设备，发酵效果将更好。
3固体发酵工艺流程
• 4 固体发酵工艺条件
• 固体发酵过程中的温度、湿度、时间、水分、pH 值等因素及其交互作用对发酵有显著影响，对周 态发酵而言，温度是首要因素。培养基及培养条 件的优化，是降低酶制剂成本、提高酶活、实现 其工业化生产的重要措施。一般认为利用真菌进 行固态发酵最好将培养基的起始pH值调为酸性， 这样有利于真菌的生长而抑制细菌的滋生。固态 发酵培养基的初始含水量，应视纤维素材料种类 不同而异。
纤维素酶的组成及性质
• 3 ： β- 葡 萄 糖 苷 酶 (β-glucosidases ， β-6 或 BG) 或 β-D- 葡 萄 糖 苷 一 葡 萄 糖 水 解 (EC3.2.1.21) ， 又 称 纤 维 二 糖 酶 (cellobiase ， CB)，它主要裂解纤维二糖和从小的纤维素 糊精的非还原末端水解葡萄糖残基，生成葡 萄糖产物。它的水解速率随底物大小的降低 而增加，以底物为纤维二糖时水解速率最快 咖。严格地讲，β-葡萄糖苷酶不能算作纤维 素酶，但它可以减轻纤维二糖对纤维素酶的 反馈抑制作用。
②二是对天然纤维素降解能力强，但分泌到胞外的纤 维素酶系活力较低，如担子菌类等；
③三是对天然纤维素分解能力强，但基本无纤维素酶 分泌到胞外，如厌氧细菌的纤维素酶系。
纤维素酶的组成及性质
1：外切葡聚糖酶包括两类酶， 一类：是β-1，4-D-葡聚糖一葡萄糖水解酶，也称为纤 维素糊精酶(Ec3.2.1.74)； 二类：酶为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases CBH)， 即β-1，4-D-葡聚糖一纤维二糖水解酶(exo-B-1，4-Dglucanases，EC3.2.1.91)，简称外切酶。CBH是纤维 素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解过程中起主 导作用，可以水解微晶纤维素和棉花等结晶度高的纤维 素，作用于无定形纤维素的非还原末端或还原端，水解 β-1，4一糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子，生成可 溶的纤维糊精和纤维二糖。
纤维素酶的作用原理
• 纤维素酶降解纤维素的部位优先发生在无定形区 的理论已得到普遍认可。
• 这种理论认为，首先内切型纤维素酶作用于纤维 素分子内部的无定形区，随即水解β-1，4-糖苷键， 将纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的 小分予纤维素，随后外切型纤维素酶，又称纤维 二糖水解酶，作用于纤维素线状分子末端，水解 β-1，4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。最 后，葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。
纤维素酶理化特性
六：纤维素酶的诱导性
• 真菌纤维素酶是诱导酶，在诱导物存在下才能产 生。许多不溶性的纤维素、可溶性的纤维素衍生 物、一些低聚糖类以及某些单糖和二糖均可作为 纤维素的诱导物。Nisizawa研究发现，纤维素、 纤维二糖、槐糖、纤维索衍生物等都能诱导里氏 木霉和绿色木霉产生纤维素酶。然而值得注意的 是，纤维二糖、葡萄糖等低分子可溶性糖在低浓 度时有促进作用，而较高浓度时便开始抑制。当 然，对于不同微生物来说，同一浓度、同一物质 也可能有着不同甚至完全相反的作用。
纤维素酶的发酵工艺
• 玉米秸秆培养基适宜的含水量为1:(2—2.5)(w／w)，麦秸培养 基适宜的含水量为1:(1—1.5)，啤酒糟培养基的含水量为1:1。 靖德兵等采用均匀设计U15(58)和双温度培养法(前30 h恒温 30℃，后续恒温27℃)进行康氏木霉产酶固体发酵生产纤维素 酶条件的研究，结果表明，应用双温度培养法进行康氏木霉固 体发酵生产纤维素酶时，在自然补给氧气、培养基pH值自然 (约6.5)并保持环境湿度约60％的条件下，72 h是适宜的发酵周 期。徐福建等提出了纤维素酶气相双动态固态发酵的方式：在 优化条件下(最佳压力脉冲范围、脉冲频率及气体内循环速率)， 发酵温度得到较好地控制，910 cm高的填料层中最大温度梯 度为0.12 s℃／cm；以汽爆秸秆为底物，发酵水活度得到较好 的保持；动态培养发酵周期(60 h)比静态发酵周期(84 h)缩短了 1／3，酶活(20 136 IU／g)比静态酶活(10 182 IU／g)提高了1 倍，压力脉动固态培养的料层上中下微生物生长状况均匀一致 且疏松，而静态固态发酵的料层中部几乎没有菌体生长。利用 气相双动态固态发酵可为纤维素酶大规模生产奠定基础。
纤维素酶理化特性
四：纤维素酶的最适ph值 • 纤维素酶酶活对环境pH值很敏感，不同菌种、不
同组分的纤维素酶最适pH值有差异。如曲霉、青 霉及木霉产生的酸性纤维素酶，一般在酸性环境 pH4.0～5.0有较高活性。田新玉从200余株嗜碱 细菌中筛选到一株产碱性纤维素酶的菌株N6227， 其 酶 反 应 的 最 适 pH 值 为 8.5 。 内 切 酶 (cx) 的 最 适 pH值为5.0～7.0；C1酶和BG最适pH值为5.0左右， BG在pH值4.0～8.0时稳定。
• 依赖于人们对纤维素酶的发现和认识。纤维素为 一种具有巨大潜力的。
引言
全世界农作物秸秆年产量超过20亿吨，仅我国每 年秸秆产量就高达7亿吨。由于其中含有大量的纤 维素，营养价值低，难以被畜禽利用，因此只有 很少一部分用作饲料，少量用来过腹还田或直接 还田嘲，而大约有45％～47％作为燃料补充农村 能源不足，15％以烧荒形式烧掉或丢弃。秸秆直 接利用率较低，如不对这类纤维素废物加以有效 地利用，不仅会严重污染环境，而且也造成资源 的极大浪费，因此探索纤维素类废弃物的处理措 施，对其进行有效利用是21世纪的重大课题。
纤维素的结构
什么是纤维素酶？
纤维素酶：纤维素酶是酶的一种，在分解纤维素时 起生物催化作用,是多组分酶体系，是具有纤维素 降解能力酶的总称。
• 按照纤维素降解微生物一是对天然纤维素的降解能力比较弱，但可大量合 成分泌到胞外的纤维素降解酶系，酶的组分是游离 的，如常见的木霉、青霉的纤维素酶系；
• 发酵培养基为 0 .7 5 ％CMC - N a ， ( NH4)2SO4 ， 2 ％吐温 8 0 ， 其余同种子培养基．
方法
• 1. 刚果红染色法 菌落长成后， 往选择平板 中加入适量 1×10 - 3g／mL的刚果红溶液， 染色 l h；弃去染液， 加入适量 lmo l/L的 NaCI 溶液， 洗涤 1 h ． 菌体若能分泌纤 维素酶， 则在菌落周围会出现清晰的透明 水解圈， 依据透明圈与菌落直径比值的大 小选择产酶菌株．
菌种选育
• 采集到的土壤样本经无菌水洗涤后， 吸取 上清液梯度稀释，选取适当浓度涂布选择 培养基，挑选出几 株菌， 纯化保藏． 用 刚果红染色法在选择培养基中复筛， 挑选 出4株有较强纤维素水解能力的菌株， 液 体培 养基中发酵， 测其纤维素酶的活性， 选择其中酶活性最高的一株保藏备用。
发酵过程
纤维素酶的发酵工艺
• 纤维素酶的分布非常广泛，主要有三个来源：
1微生物来源：主要有霉菌、担子菌等真菌，也包括细 菌、放线菌和一些原生动物。真菌中活力较高的是木 霉、黑曲、青霉和根霉等，细菌中有纤维杆菌、球形 生孢纤维粘菌等，目前研究较多的是绿色木霉和纤维 杆菌；
2是动物性来源：利用反刍动物瘤胃液制备纤维素酶的 粗酶制剂；
纤维素酶的组成及性质
• 2:内切纤维素酶(endoglueanases，EG)或 内切葡聚糖酶，即内切1，4-β—D-葡聚糖 q一葡聚糖水解酶(endo-β-glucanasea， EC3.2.1.4)，简称内切酶，也称cx酶， CMC酶。内切纤维素酶随即地水解磷酸膨 胀纤维素，羧甲基纤维素等无定形纤维素 的非定形区，无规则水解β-1，4糖苷键， 形成葡萄糖、纤维二糖纤维三糖和不同大 小的纤维糊精，为纤维二糖水解酶提供更 多的可供水解的末端。
纤维素酶理化特性
五：纤维素酶的多样性
产纤维素酶微生物一般不会只有一类纤维素酶组分。
试验证明，S.pulverhlentum培养液就包括五种内切葡 聚糖酶和两种不同的BG。T. emersonii的胞外酶包括
三种BG、四种cx和五种外切酶。即使只产生一类纤维 素酶组分，也往往有多种不同的形式。Elena．S等报 道，一种白热担子菌(phanerochaete chrysosporium) 依靠碳源，能在细胞外、细胞内和细胞壁上产生三种 不同的BG，其相应的相对分子量分别为96kDa、 98kDa和114kna。同一微生物，也可能因为不同的地 区来源、不同的培养条件而使得纤维素酶的成分有很 大差别，这也是纤维素酶多样性的表现。
纤维素酶理化特性
二：等电点
➢等电点(pI)是蛋白质分子的重要理化特征。 纤维素酶系中各组分的等电点随菌种来源、 培养条件的变化而异。
➢一般认为，木霉属真菌产的CBHI的pI值约 为4.2，CBHII的pI值约为5.9。真菌EGI的pI 值约为4.7，EGUI的pI值为4.8～5.6(也有报 道约为7.47)，BG的pI值约为7.5～8.5。
纤维素酶的发酵
引言
• 纤维素是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合 物，绝大多数由绿色植物通过光合作用合成。据 估计，地球纤维素每年通过光合作用的更新量约 为4.0X 1010吨。
• 纤维素是地球上最丰富的多糖物质，是植物细胞 壁的主要组分，占植物秸秆干重的l／3～l／2，也 是自然界存在的最多的一类可再生生物聚合物。
纤维素酶理化特性
三：最适温度
• 酶反应存在一个最适温度。一般纤维素酶的最适 温度范围为40—60℃。纤维素酶各组分热稳定性 也存在差异，内切酶(Cx)的最适温度为50～60℃， 热稳定性好，在95℃时仍保留一般的酶活性；不 同来源的β—葡萄糖苷酶的最适温度均为50～60 ℃ 。然而有研究报道，β—葡萄糖苷酶具有很高 的耐温性，在50℃保温60h，仍保持95%以上的 活性，最适温度为70℃。也有报道，康宁木霉中 的外切酶(C1)具有特殊的热稳定性，其最适温度 为40～60℃。
纤维素酶的发酵工艺
一:固体发酵工艺
• 1 固体发酵工艺特点: 固体发酵法又称麸曲培养法，是
以秸秆粉、废纸、玉米秸秆粉为主要原料，拌入种曲 后．装入盘或帘子上，摊成薄层(厚约1 cm)，在培养室一 定温度和湿度(RH 90％一100％)下进行发酵。 • 其主要特点是发酵体系没有游离水存在，微生物是在有足 够湿度的固态底物上进行反应，发酵环境接近于自然状态 下的微生物生长习性，产生的酶系更全，有利于降解天然 纤维素，且投资低、能耗低、产量高、操作简易、回收率 高、无泡沫、需控参数少、环境污染小等。但固体发酵法 易被杂菌污染，生产的纤维素酶分离纯化较难．且色素不 易去除。
纤维素酶理化特性
一：分子量
• 不同来源、不同组分的纤维素酶分子量差别较大，其变化 范围很广。
• 目前普遍认为： ✓ 1.内切酶分子量介于23～146kDa；（但有研究认为）内
切酶相对分子量介于23～118kDa(胞内酶)和47～ 76kDa(胞外酶)。 ✓ 2.真菌EG的两种异构酶，EGI的分子量约为54kDaEGⅢ的 分子量约为49.8kDa。 ✓ 3.外切酶分子量介于38～118kDa，木霉属真菌产的CBH 1分子量约为66kDa，CBHII的分子量为53kDa；13—葡 萄糖苷酶为90～l00kDa(胞内酶型)和47～76kDa(胞外酶 型)。
• 2 .还原糖的测定 采用 3 ， 5 — 二硝基水杨 酸法( DNS法) ．
方法
• 3 .滤纸酶( FPase ) 活性测定：试管底部预 先放置适当大小的滤纸( 约 5 0 mg ) ， 加 入1mL样品与 1.5 mL柠檬酸一 Na 2 HP O4 缓冲液( 0. 2 mo l ／ L， p H5 . 0 )， 50℃ 保温 1 h，扣除本底,测定反应后还原糖的含 量． 酶活定义为上述条件下， 每小时催化 生成 lμg葡萄糖的酶量为一个 U ．
3生物工程来源：迄今，人们已从40多种细菌和数种 真菌中克隆 行改造，使其活性提高，耐受性增强。
培养基
• 选择培养基以羧甲基纤维素钠( CMC-Na) 取代查 氏培养基中的蔗糖， 其余配方不变；
• 种子培养基为 0.7 5 ％CMC - Na ,0 . 5 ％蛋白胨， 2％吐温 8 0， 0 .0 3 ％MgSO4 、 CaCl2 ， H2O， 微量 FeSO4 ,MnSO4 , ZnSO4 ,CoCI2 ， 自然 p H；
纤维素酶的发酵工艺
2 固体发酵设备浅盘发酵器
是比较常用的一种固态发酵设备，培养基经灭菌冷却后装入 浅盘，通过空气增湿器调节空间的温湿度进行发酵，工业 化程度较低。固体发酵设备发展的趋向是机械化发酵罐， 尤其是流化床式固体发酵设备，发酵效果将更好。
3固体发酵工艺流程
• 4 固体发酵工艺条件
• 固体发酵过程中的温度、湿度、时间、水分、pH 值等因素及其交互作用对发酵有显著影响，对周 态发酵而言，温度是首要因素。培养基及培养条 件的优化，是降低酶制剂成本、提高酶活、实现 其工业化生产的重要措施。一般认为利用真菌进 行固态发酵最好将培养基的起始pH值调为酸性， 这样有利于真菌的生长而抑制细菌的滋生。固态 发酵培养基的初始含水量，应视纤维素材料种类 不同而异。
纤维素酶的组成及性质
• 3 ： β- 葡 萄 糖 苷 酶 (β-glucosidases ， β-6 或 BG) 或 β-D- 葡 萄 糖 苷 一 葡 萄 糖 水 解 (EC3.2.1.21) ， 又 称 纤 维 二 糖 酶 (cellobiase ， CB)，它主要裂解纤维二糖和从小的纤维素 糊精的非还原末端水解葡萄糖残基，生成葡 萄糖产物。它的水解速率随底物大小的降低 而增加，以底物为纤维二糖时水解速率最快 咖。严格地讲，β-葡萄糖苷酶不能算作纤维 素酶，但它可以减轻纤维二糖对纤维素酶的 反馈抑制作用。
②二是对天然纤维素降解能力强，但分泌到胞外的纤 维素酶系活力较低，如担子菌类等；
③三是对天然纤维素分解能力强，但基本无纤维素酶 分泌到胞外，如厌氧细菌的纤维素酶系。
纤维素酶的组成及性质
1：外切葡聚糖酶包括两类酶， 一类：是β-1，4-D-葡聚糖一葡萄糖水解酶，也称为纤 维素糊精酶(Ec3.2.1.74)； 二类：酶为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases CBH)， 即β-1，4-D-葡聚糖一纤维二糖水解酶(exo-B-1，4-Dglucanases，EC3.2.1.91)，简称外切酶。CBH是纤维 素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解过程中起主 导作用，可以水解微晶纤维素和棉花等结晶度高的纤维 素，作用于无定形纤维素的非还原末端或还原端，水解 β-1，4一糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子，生成可 溶的纤维糊精和纤维二糖。
纤维素酶的作用原理
• 纤维素酶降解纤维素的部位优先发生在无定形区 的理论已得到普遍认可。
• 这种理论认为，首先内切型纤维素酶作用于纤维 素分子内部的无定形区，随即水解β-1，4-糖苷键， 将纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的 小分予纤维素，随后外切型纤维素酶，又称纤维 二糖水解酶，作用于纤维素线状分子末端，水解 β-1，4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。最 后，葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。
纤维素酶理化特性
六：纤维素酶的诱导性
• 真菌纤维素酶是诱导酶，在诱导物存在下才能产 生。许多不溶性的纤维素、可溶性的纤维素衍生 物、一些低聚糖类以及某些单糖和二糖均可作为 纤维素的诱导物。Nisizawa研究发现，纤维素、 纤维二糖、槐糖、纤维索衍生物等都能诱导里氏 木霉和绿色木霉产生纤维素酶。然而值得注意的 是，纤维二糖、葡萄糖等低分子可溶性糖在低浓 度时有促进作用，而较高浓度时便开始抑制。当 然，对于不同微生物来说，同一浓度、同一物质 也可能有着不同甚至完全相反的作用。
纤维素酶的发酵工艺
• 玉米秸秆培养基适宜的含水量为1:(2—2.5)(w／w)，麦秸培养 基适宜的含水量为1:(1—1.5)，啤酒糟培养基的含水量为1:1。 靖德兵等采用均匀设计U15(58)和双温度培养法(前30 h恒温 30℃，后续恒温27℃)进行康氏木霉产酶固体发酵生产纤维素 酶条件的研究，结果表明，应用双温度培养法进行康氏木霉固 体发酵生产纤维素酶时，在自然补给氧气、培养基pH值自然 (约6.5)并保持环境湿度约60％的条件下，72 h是适宜的发酵周 期。徐福建等提出了纤维素酶气相双动态固态发酵的方式：在 优化条件下(最佳压力脉冲范围、脉冲频率及气体内循环速率)， 发酵温度得到较好地控制，910 cm高的填料层中最大温度梯 度为0.12 s℃／cm；以汽爆秸秆为底物，发酵水活度得到较好 的保持；动态培养发酵周期(60 h)比静态发酵周期(84 h)缩短了 1／3，酶活(20 136 IU／g)比静态酶活(10 182 IU／g)提高了1 倍，压力脉动固态培养的料层上中下微生物生长状况均匀一致 且疏松，而静态固态发酵的料层中部几乎没有菌体生长。利用 气相双动态固态发酵可为纤维素酶大规模生产奠定基础。
纤维素酶理化特性
四：纤维素酶的最适ph值 • 纤维素酶酶活对环境pH值很敏感，不同菌种、不
同组分的纤维素酶最适pH值有差异。如曲霉、青 霉及木霉产生的酸性纤维素酶，一般在酸性环境 pH4.0～5.0有较高活性。田新玉从200余株嗜碱 细菌中筛选到一株产碱性纤维素酶的菌株N6227， 其 酶 反 应 的 最 适 pH 值 为 8.5 。 内 切 酶 (cx) 的 最 适 pH值为5.0～7.0；C1酶和BG最适pH值为5.0左右， BG在pH值4.0～8.0时稳定。
• 依赖于人们对纤维素酶的发现和认识。纤维素为 一种具有巨大潜力的。
引言
全世界农作物秸秆年产量超过20亿吨，仅我国每 年秸秆产量就高达7亿吨。由于其中含有大量的纤 维素，营养价值低，难以被畜禽利用，因此只有 很少一部分用作饲料，少量用来过腹还田或直接 还田嘲，而大约有45％～47％作为燃料补充农村 能源不足，15％以烧荒形式烧掉或丢弃。秸秆直 接利用率较低，如不对这类纤维素废物加以有效 地利用，不仅会严重污染环境，而且也造成资源 的极大浪费，因此探索纤维素类废弃物的处理措 施，对其进行有效利用是21世纪的重大课题。
纤维素的结构
什么是纤维素酶？
纤维素酶：纤维素酶是酶的一种，在分解纤维素时 起生物催化作用,是多组分酶体系，是具有纤维素 降解能力酶的总称。
• 按照纤维素降解微生物一是对天然纤维素的降解能力比较弱，但可大量合 成分泌到胞外的纤维素降解酶系，酶的组分是游离 的，如常见的木霉、青霉的纤维素酶系；
• 发酵培养基为 0 .7 5 ％CMC - N a ， ( NH4)2SO4 ， 2 ％吐温 8 0 ， 其余同种子培养基．
方法
• 1. 刚果红染色法 菌落长成后， 往选择平板 中加入适量 1×10 - 3g／mL的刚果红溶液， 染色 l h；弃去染液， 加入适量 lmo l/L的 NaCI 溶液， 洗涤 1 h ． 菌体若能分泌纤 维素酶， 则在菌落周围会出现清晰的透明 水解圈， 依据透明圈与菌落直径比值的大 小选择产酶菌株．
菌种选育
• 采集到的土壤样本经无菌水洗涤后， 吸取 上清液梯度稀释，选取适当浓度涂布选择 培养基，挑选出几 株菌， 纯化保藏． 用 刚果红染色法在选择培养基中复筛， 挑选 出4株有较强纤维素水解能力的菌株， 液 体培 养基中发酵， 测其纤维素酶的活性， 选择其中酶活性最高的一株保藏备用。
发酵过程
纤维素酶的发酵工艺
• 纤维素酶的分布非常广泛，主要有三个来源：
1微生物来源：主要有霉菌、担子菌等真菌，也包括细 菌、放线菌和一些原生动物。真菌中活力较高的是木 霉、黑曲、青霉和根霉等，细菌中有纤维杆菌、球形 生孢纤维粘菌等，目前研究较多的是绿色木霉和纤维 杆菌；
2是动物性来源：利用反刍动物瘤胃液制备纤维素酶的 粗酶制剂；
纤维素酶的组成及性质
• 2:内切纤维素酶(endoglueanases，EG)或 内切葡聚糖酶，即内切1，4-β—D-葡聚糖 q一葡聚糖水解酶(endo-β-glucanasea， EC3.2.1.4)，简称内切酶，也称cx酶， CMC酶。内切纤维素酶随即地水解磷酸膨 胀纤维素，羧甲基纤维素等无定形纤维素 的非定形区，无规则水解β-1，4糖苷键， 形成葡萄糖、纤维二糖纤维三糖和不同大 小的纤维糊精，为纤维二糖水解酶提供更 多的可供水解的末端。
纤维素酶理化特性
五：纤维素酶的多样性
产纤维素酶微生物一般不会只有一类纤维素酶组分。
试验证明，S.pulverhlentum培养液就包括五种内切葡 聚糖酶和两种不同的BG。T. emersonii的胞外酶包括
三种BG、四种cx和五种外切酶。即使只产生一类纤维 素酶组分，也往往有多种不同的形式。Elena．S等报 道，一种白热担子菌(phanerochaete chrysosporium) 依靠碳源，能在细胞外、细胞内和细胞壁上产生三种 不同的BG，其相应的相对分子量分别为96kDa、 98kDa和114kna。同一微生物，也可能因为不同的地 区来源、不同的培养条件而使得纤维素酶的成分有很 大差别，这也是纤维素酶多样性的表现。
纤维素酶理化特性
二：等电点
➢等电点(pI)是蛋白质分子的重要理化特征。 纤维素酶系中各组分的等电点随菌种来源、 培养条件的变化而异。
➢一般认为，木霉属真菌产的CBHI的pI值约 为4.2，CBHII的pI值约为5.9。真菌EGI的pI 值约为4.7，EGUI的pI值为4.8～5.6(也有报 道约为7.47)，BG的pI值约为7.5～8.5。