微生物生理生化实验实验

三、实验器材
• 恒温水浴锅，接种针，接种环，试管架， 记号笔，滴管； • 蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基， 柠檬酸盐培养基（西蒙氏培养基）； • 甲基红试剂，V.P试剂，吲哚试剂，40% KOH溶液（内含0.3%肌酸），乙醚，6% α-萘酚酒精溶液； • 大肠杆菌，产气肠杆菌，枯草芽孢杆菌， 普通变形杆菌。
1、吲哚试验（indol test）
• 含有色氨酸酶的细菌，能分解蛋白质中的色氨酸 产生吲哚（靛基质），吲哚本身没有颜色，不为 肉眼所见，当加入对二甲氨基苯甲醛试剂后，形 成可见的红色化合物，即玫瑰吲哚
2、甲基红试验（methyl red test）
• 肠道细菌可分解葡萄糖产生丙酮酸，并使丙酮酸进一步分 解为甲酸、乙酸、乳酸等。对于一些细菌如大肠杆菌、沙 门氏菌等，发酵葡萄糖产酸较多，使培养基pH下降到4.2 甚至更低，因此可用指示剂甲基红（反应范围pH4.2红～ 6.3黄）指示出来。
五、注意事项
• 1.柠檬酸盐利用试验应防止琼脂中的杂质，同时制备培 养基时应严格调节pH值。 • 2. V.P反应要求在与空气充分接触下完成，肠杆菌 产气杆菌 变形杆菌 吲哚试验 MR试验 V.P反应 柠檬酸盐利用
七、思考题
1. 为什么说进行生理生化试验必须是纯培养？ 2. 培养物中的吲哚是怎样产生的？又是通过什么 方法来测定的？
四、实验步骤
1、培养基制备（略，已准备）：蛋白胨水培 养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐 培养基 2、培养基编号 3、接种：按要求接种 4、培养：37℃温箱中培养 5、生理生化反应及观察
（1）吲哚试验
• 培养后取出，先加入乙醚约1ml（使呈现明显的乙醚层）， 充分震荡后沿试管壁缓缓滴加吲哚试剂5-10滴，观察有无 红色环出现。注意：加入吲哚试剂后不可再动摇!有红色 环出现者为阳性，反之为阴性
3、伏普反应（Voges-Proskauer reaction ）
• 产气杆菌能进行丁醇发酵，可使丙酮酸脱羧，生成中性的 乙酰甲基甲醇（3-羟基丁酮）可通过V.P试验检测出来。 在碱性条件下，乙酰甲基甲醇可被空气中的氧所氧化，生 成二乙酰（丁二酮），二乙酰再与蛋白质中精氨酸的胍基 作用，生成红色化合物，即为V.P反应阳性。
（2）甲基红试验
• 取出培养物，在培养液中加入几滴甲基红试剂（约每毫升 培养液加指示剂1滴），立即观察结果，呈现红色为甲基 红试验阳性，桔红色为弱阳性，桔黄或黄色为阴性反应。
（3）V.P反应试验 • 取出培养物2 ml，加入与培养基等量的V.P试剂， 充分振荡，放置37℃温箱中30min，观察。呈红 色者为阳性，不呈红色者为阴性。 （4）柠檬酸盐的利用试验 • 取出培养物，观察，培养基上有菌苔生长且变为 蓝色即为阳性反应；无菌生长、培养基仍为绿色 者为阴性反应。凡阴性反应者，最好继续培养观 察至第7 d。
4、柠檬酸盐试验（citrate test） • 柠檬酸盐培养基是合成培养基，不含蛋白 胨和糖类，柠檬酸盐为唯一碳源。有的细 菌如产气杆菌能利用柠檬酸钠作为碳源， 柠檬酸钠为弱酸强碱盐，被分解利用后使 培养基pH值升高，由中性变为碱性，可使 培养基中的指示剂溴麝香草酚蓝（反应范 围pH6.0～7.6，黄色～蓝色）由绿变蓝。
微生物生理生化实验实验
微生物学教研室
一、教学目的与要求
1 要求学生了解IMViC试验的原理及在肠道 菌鉴定中的意义。 2 掌握IMCiV及硫化氢试验的操作。 • 教学时数：6学时
二、试验原理
★微生物体内各种酶系统控制的复杂多样的生化反 应完成 ；测定微生物某些酶类的有无、对底物 作用与否、反应的条件、反应的产物及代谢方 式都属于生理生化实验内容。 ★在培养基内或在培养完成之后加入特定的指示剂 就可确定所发生的生理生化反应类型。 ★常用的试验：糖代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢 试验、氮源和碳源的利用试验及酶的试验等。
• IMViC是四个生理生化反应英文词第一个字 母的缩写，I表示吲哚试验（indol test）、 M表示甲基红试验（methyl red test）、V 表示伏普反应（Voges-Proskauer reaction，小写之i使之成为一个可发音的 单词）、C表示柠檬酸盐试验（citrate test）。这四个试验在肠道细菌的鉴别中常 常作为一组常规生理生化试验来进行。