反胶束萃取技术的应用现状研究

反胶束萃取技术的应用现状研究
【标题】反胶束萃取技术的应用现状研究【作者】李艳萍【关键词】反胶束??萃取??应用现状??前景【指导老师】赵小辉
【专业】化学【正文】
1.引言
传统的液--液萃取分离技术成本低,易于运作,已广泛用于多组分物质的分离。

但是,由于缺乏相应的生化溶剂,采用该技术难以分离蛋白质、核酸等生物活性物质;液相色谱技术,特别是制备型色谱技术的应用,使大多数生物分子的批量分离成为可能。

然而由于该技术本身也存在某些局限性,例如一定的固定相,有时会引起目标物的不可逆吸附、甚至变性等现象,在一定程度上限制了其在生化工程中的应用。

近年来,以反胶束溶液为新的溶剂系统的萃取分离技术,可以选择性分离某些生物活性分子,而逐渐引起了人们的重视。

近年来,反胶束萃取技术结合其他一些技术、方法的应用正在研究和开发,显示了良好的应用前景。

该法已成功地用于胞内外酶的萃取及酶蛋白的复性。

如70年代,Ｗells等[1]首次提出反胶束中的酶蛋白仍具有活性,并在一定的pH值和离子强度等条件下,反胶束可提取酶蛋白。

其后,反胶束萃取酶蛋白的研究日新月异,发展迅速。

国内外均有大量的研究报道,如Somnuk等[2]用反胶束萃取鸡蛋中的溶菌酶,Zhang等[3]用十六烷基二甲基溴化铵?(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)反胶束提取酵母乙醇脱氢酶等。

近年来,此项技术又有了诸多的新进展,如设计新表面活性剂和添加亲和性配基、反胶团乳化液膜萃取、用反离
子表面活性剂反萃取胶团中酶蛋白及设计新的萃取设备等,解决了传统方法所遇到的酶失活、萃取选择性差等问题,从而大大促进其工业应用的发展。

反胶束萃取技术之所以日益受到了广泛的重视,是因其具有甚多突出优点:①有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性;②分离、浓缩可以同时进行,过程简单;
③条件温和不会引起酶蛋白的变性,并能解决酶蛋白(如细胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题;④由于构成反胶束的表面活性剂往往具有细胞破壁功效,因而可直接从完整细胞中提取有活性的酶蛋白;⑤反胶束萃取技术的成本低,溶剂和表面活性剂可反复使用。

可见,反胶束萃取酶蛋白具有较好的应用前景。

2.反胶束的相关理论
反胶束(也称反胶团)是表面活性剂在非极性有机溶剂中超过临界胶团浓度时自发形成热力学稳定、光学透明的球状或圆柱状聚集体[4]。

表面活性剂的疏水的非极性尾部指向有机溶剂,亲水的极性头部指向聚集体内部形成一个纳米级大小的极性腔。

此极性腔容纳一定量的水,其内部接近细胞内环境,不仅能溶解亲水性分子如氨基酸、多肽和蛋白质等,而且能保持它们的活性。

2.1反胶束技术原理
反胶束或称逆胶束是表面活性剂分散于连续的有机相中自发形成的与正常胶束结构相反的一种含水聚合体。

在反胶束中,组成反胶束的表面活性剂的极性基团朝内形成一个内表面,与平衡离子和水一起构成一个极性核心,称为“水池”，极性分子可溶于这个水池中[5]。

蛋白质就是被溶解于“水池”中而被分离萃取，酶也可以被固定在反胶束的“水池”中进行催化作用。

2.2反胶束萃取原理[6]
表面活性剂溶于水中,当其浓度超过临界胶束浓度时,便形成聚集体,称为正常胶
束。

表面活性剂溶于有机溶剂,当浓度大于临界胶团浓度时,会在有机相中形成聚集体,称为反胶束.。

萃取时,待萃取的原料液以水相形式与反胶束体系接触,调节各种参数,使其中要提取的物质以最大限度转入反胶束体系(前萃取),后将含该物质的前萃液与另外一个水相接触,再次调节pH、离子强度等参数分离出要提取
物质。

2.3反胶束的形成条件及特征
0>.体系的组成
表面活性剂溶于有机溶剂,当浓度大于临界胶团浓度时,会在有机相中形成聚集体,称为反胶束。

反胶束中以极性头朝内非极性头朝外排列,形成亲水内核,称为“水池”,可增溶蛋白质和酶。

形成反胶束体系的常用有机溶剂有异辛烷、正己烷等,常用的表面活性剂有二(2?乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)、十六烷基三甲基溴化铵CTAB)、三辛基甲基氯化铵TOMAC)等,有时添加助溶剂可以增加反胶束
体系的稳定性。

.体系的性质[5]
反胶束体系的性质常用W0、θ和N等参数表示,其中W0是形成反胶束微粒的水分子与表面活性剂分子数之比,是衡量反胶束体系增溶能力最重要的参数。

θ(mol/L)是增溶的水相对于有机相总体积的浓度,N是组成反胶束微粒的表面活性剂分子堆砌数。

一般W0越大,有机相形成反胶束微粒的直径越大;当W0一定时,
θ与N决定了反胶束微粒的相对浓度。

.在反胶束体系的增溶模型
蛋白质或酶在静电或疏水作用下增溶于反胶束微粒,其溶解模型通常有以下3种形式：Luisi[7]的水壳模型认为，蛋白质分子的溶解导致反胶束尺寸的增大；
Martinek[8]的诱导契合模型认为，当蛋白分子尺寸大于反胶束微粒时，表面活性剂可在蛋白质分子诱导下重新分配，形成更大聚集数的胶束,使蛋白质溶于其中；另外固定尺寸模型[9]认为蛋白质分子等于或小于反胶束微粒尺寸时,溶解后
的反胶束尺寸不变。

3.反胶束萃取技术的应用现状
3.1在食品科学中的应用
.中同时分离油和蛋白质
植物蛋白提取的传统方法是从脱脂粕中萃取分离,工艺复杂,能耗高且易引起蛋白质变性,造成大量的蛋白质资源浪费。

反胶束溶液不仅可以萃取植物蛋白质,同时还可以分离出植物油脂,是反胶束萃取技术在食品中应用的热点之一[8]。

.合成和水解
脂肪酶催化油脂水解克服了高温高压蒸汽裂解工艺高耗能的缺点,然而脂肪酶是一种作用于油水界面上的水解酶,其底物油脂在水中不易分解且长时间接触有机溶剂易使酶失活。

反胶束系统一方面提供了巨大的油水相界面;另一方面,增溶于其中的脂肪酶又能得到有效的保护,并且一定程度上排除了底物或产物对酶催化活性的抑制。

Fernandes等人[10]利用AOT/异辛烷反胶束体系，研究TLL脂肪酶(Thermomyceslanuginoseli pase)催化合成十二烷酸乙酯反应。

优化实验表明,在反应温度为30℃、pH5.6、W0为10、醇/酸摩尔比为1∶5.0时，反应1h后,酯合成率可达92%。

Kazumitsu Naeo等[11]在DKF 110糖酯/正己烷反胶束体系中，以代氏根酶脂肪酶催化油酸和正辛醇酯化反应。

实验发现,反应温度40℃、pH6、W02.5时，脂酶活力达到最大值；反应进行28h后，有机相中酶催化反应活性仍可保持40%。

该体系表面活性剂糖酯为食用级乳化剂，可用于食品制造。

3.2在生物工程中的应用
.白质混合物
制备含有蛋白质的反胶束相有3种方法[12]：(1)相转移法。

一般把含有表面活性剂的有机相与含有蛋白质的水相接触，通过搅拌,蛋白质会缓慢地从水相转移到有机相中。

这种方法形成的最终体系是稳定的，且可以在低Ｗ0下得到高蛋白浓度。

(2)注射法。

这是最常用的方法。

蛋白质溶液直接注入含有表面活性剂的有机相中，搅拌成光学澄清的溶液。

这种方法易控制水的含量和水核的尺寸。

(3)溶解法。

用反胶团溶液与固体蛋白质粉末接触来使蛋白质进入反胶团。

这种方法
适用于水不溶性蛋白质。

.化蛋白质
分离蛋白质混合物的研究主要为纯酶形成的纯物质模型系统，反胶束萃取法还可以从复杂的培养基，如发酵液或粗提液中直接萃取蛋白质。

Krienger等人[13]用AOT异辛烷反胶束体系从桔青霉的粗提物中提取和纯化了脂肪酶。

发酵结束后桔青霉菌丝体经过滤，收集含有脂肪酶的上清液得到粗提液,再经萃取可得脂肪酶。

Soni等人[14]用同样的反胶束体系从发酵液中提取了黑曲霉的胞外酸性磷酸酯酶。

实验结果表明，萃取和反萃取在最优条件下，可从最初发酵液中获得
29%的酸性磷酸酯酶。

..1寻找更好的新的反胶束体系
最早应用于提取蛋白质等生物大分子的反胶束体系是单一反胶束体系(即只由一种表面活性剂构成的反胶束体系)。

这种反胶束体系种类较少,它一般只适用于小分子蛋白质、肽类和氨基酸的萃取(分子质量30ＫDa),不能萃取分子质量较大的生物大分子,并且往往在两相界面上形成不溶性凝胶状物质。

单一反胶束体系中
常用的表面活性剂主要是阴离子型表面活性剂,如:AOT、双油基磷酸(DOLPA)等。

利用非离子型表面活性剂单独形成反胶束体系的研究很少,主要有Triton类和Span类等[15]。

有关混合反胶束体系(即采用两种以上的表面活性剂配伍构成的反胶束体系)的研究越来越多。

Goto等[16]用AOT/DOLPA混合反胶束体系萃取α胰凝乳蛋白酶,发现混合反胶束体系的萃取能力高于一般的单一反胶束体系,并且比单一反胶束体系反萃容易。

如果选择好配伍的表面活性剂的种类及配比[一般采用阴离子型表面活性剂和卵磷脂(一种天然的两性离子表面活性剂)配伍,如AOT/卵磷脂],可使混合反胶束体系在萃取时具有较高的选择性。

由于单一反胶束体系和混合反胶束体系在提取蛋白质等生物大分子时选择性都不高,为了提高反胶束体系在萃取时的选择性,亲和反胶束体系的研究逐渐成为了反胶束萃取研究的重点。

亲和反胶束体系是在反胶束体系中导入与目标产物有特异性亲和作用的亲和助表面活性剂形成的。

这种亲和助表面活性剂的极性基是一种亲和配基,可选择性的结合目标产物。

采用亲和反胶束体系,可使目标产物的萃取率和选择性大大提高,而且可使操作范围(pH、离子强度)大大变宽。

Woll等[17]通过向AOT/异辛烷系统引入辛基βD吡喃葡萄糖苷,使伴刀豆球蛋白A(conA)的萃取选择性由10提高到了100,并使可发生萃取的pH范围增大。

当向水相中加入conA的自由配基(如葡萄糖)时,conA的萃取受到抑制,表明了亲和作用的重要性。

这种萃取系统主要是静电作用和亲和作用(可能还有疏水相互作用)在联合起作用。

..2 联用技术
单用反胶束体系分离纯化蛋白质等生物大分子有一些难以克服的弱点,如萃取率不高,目标产物纯度较低,有些生物大分子容易变性等。

为了提高反胶束体系在分离纯化生物产品上的实用性,反胶束体系萃取技术同一些近代分离纯化技术的联
合应用已经成为当前生物产品分离纯化技术的研究热点。

刘强等[21]用反胶束体系提取蛋白质后,再用超速离心法进行精制,效果非常理想。

Somnuk等[18]利用反离子表面活性剂反提捕获反胶束体系中的蛋白质。

Goto等[19]利用超临界流体形成的反胶束体系提取DNA获得成功。

Hashimoto等[14]用功能固体材料成功地从反胶束体系中萃取出碱性磷酸酯酶,这种液固萃取技术具有相当高的选择性并且使酶的活性收率达100%。

特别是各种膜分离技术同反胶束体系的联合应用使蛋白质等生物大分子的分离纯化效能大大提高,如Dahuron等[20]利用膜萃取,实现了AOT/异辛烷系统对α胰凝乳蛋白酶和细胞色素C的萃取分离。

最近,史清洪等[21]将卵磷脂/正己烷亲和反胶束体系用于膜分配层析,对卵清溶菌酶进行了纯化分离,经一步膜分配层析,使该酶浓缩5.5倍,纯度提高47倍。

反胶束体系和基因工程联合应用,可使包含体中的重组蛋白复性,这也是反胶束体系在分离纯化蛋白质等生物大分子上的一个非常吸引人的应用。

.蛋白和油脂的同时分离
通常用烃类有机溶剂提取向日葵籽(干重中含有35%～50%的石灰质)时，残渣中含有30%～50%的蛋白质，这种蛋白质有很高的营养价值，但不能被提取出来，这些高营养物质的渣饼只能用作饲料。

Leser等人[22]使用烃类为溶剂的反胶束溶液作为提取剂，同时萃取向日葵籽中的油和蛋白质，经萃取油被直接萃取到有机相，而蛋白质却溶入反胶束的“水池”内。

先用水溶液反萃取得到蛋白质，再用冷却反胶束溶液使表面活性剂沉淀分离，最后用蒸馏方法将油与烃类分离。

实验结果表明该方法相当优越，这将引起油脂工业和植物蛋白传统加工方式的改
变。

.离抗生素
糖肽类抗生素――万古霉素在1956年首次发现。

基于万古霉素对D丙氨酰D丙氨酸酯的特殊亲和能力，万古霉素和其他万古霉素的糖肽类抗生素的纯化都以D 丙氨酰D丙氨酸酯为亲和配基的亲和色谱分离和亲和超滤。

Su等[23]将亲和配体胆甾醇D丙氨酰D丙氨酸酯固定于AOT/异辛烷反胶束溶液中，对万古霉素
(pl=81)的分离条。