巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用
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Байду номын сангаас
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文章编号： 299;<9998=899:>94<9:49<94
生
物
技
术
通
讯
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./0123 ’/14 56017 899:
综
述
巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用
王清路， 李俏俏， 薛金艳， 窦烨， 王红艳， 张玉军， 张杰
万杰医学院 生物化学教研室， 山东 淄博 8??82@ ［ 摘要］ 本文介绍了来源于野生型石油酵母 -224@9 的巴斯德毕赤酵母的 @ 种宿主菌的不同之处， 并介绍了其甲醇诱导型 同时说明了酵母菌体内微体对合成蛋白质的作用。 从启动子类型、 启动强弱、 终止子及信号肽等方面对整合型载 基因 ! "# ， 体做了详细的介绍。在外源蛋白表达方面， 简要介绍了表达过程， 重点讨论了如何防止外源蛋白降解， 对影响毕赤酵母高效 表达的因素做了扼要论述并提出了相应的解决方案。 ［ 关键词］ 巴斯德毕赤酵母； 表达载体； 表达蛋白 ［ 中图分类号］ A3B ［ 文献标识码］ C
的培养基上生长。甲醇能诱导其表达甲醇代谢所需的酶， 如 二羟丙酮合成酶（ 和过氧化氢酶（ ， 表达的 C)b 、 c+C% ） EMJM0MIG ） 而以 C)b 和 c+C% 的含量甚至可达到总细胞蛋白的 :9deB9d。 葡萄糖、 甘油或乙醇为碳源时， C)b 几乎不表达。C)b 的合成是 在转录水平调控的， 其基因启动子为诱导型。 大 多 毕 赤 酵 母 表 达 宿 主 菌 是 通 过 野 生 型 石 油 酵 母 -224@9 进行突变改造而来的， 宿主菌在组氨酸脱氢酶基因（ 处有一 ?(AE ） 突变， 用于转化后筛选重组菌株。目前 主 要 有 @ 种 表 达 宿 主 菌 ， 它们之间的区别在于 ! "# 2 个 或 8 个 基 因 的 缺 失 ， 而造成对甲 醇利用能力高低的变化。最常用的宿主菌为 ,%22? （ ， 它含 ?(AE<）
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毕赤酵母表达载体
毕赤酵母表达载体包括自我复 制 型 的 游 离 载 体 和 整 合 型 载
*
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外源蛋白在毕赤酵母中的表达
毕赤酵母表达系统表达外源蛋白的一般步骤 首先合成或克隆目的基因， 如果选 用 分 泌 型 表 达 载 体 ， 则外
体， 但以整合型载体为主。常见的整合载体又分为胞内表达和分 胞内表达的载体有 &’()* 、 泌表达 % 类。 &’()*+、 &’()*,-+、 &$(./
11ab2ca表达系统是目前最优秀应用最广泛的外源基因表达系统之一2a它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质表达的蛋白多形成不溶性包涵体背景蛋白多表达产量低等缺陷弥补了哺乳类细胞昆虫细胞表达系统操作复杂表达水平低产业化生产造价昂贵的不足还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处8a达系统具有强有力的醇氧化酶m0ef0dsmigcb2基因启动子可严格调控外源蛋白的表达
! "#, 和 ! "#F 基因，在含甲 醇 的 培 养 基 上 以 野 生 型 速 率 生 长 。 fR30 （ ?(AE 1C*E 12GHgg! I&E ）宿主菌的 ! "#, 已 被 酿 酒 酵 母 的
因 此 只 有 依 赖 ! "#F 基 因 合 成 C)b ， 在甲醇中低 ! I&E 所 代 替 ， 速 度 生 长 。 第 @ 种 宿 主 菌 R*099 <@ （ ?(AE 1C*E 12GHJJK! I&E 的 8 个 ! "# 基 因 都 被 去 除 ， 不能在含甲醇的培养 ! "#FJJD?(AE ） 基上生长。上述宿主菌经过进一步改造， 还可得到其他衍生的宿 主 菌 ， 目 前 已 有 十 几 种 不 同 的 基 因 型 。 %Rc22:@ （ ?(AE @9@E ， 和 %Rc22:B （ 是最近开发 @CLH ） %Rc22:? （ ?(AE @CLH ） ?(AE @9@E ） 的 一 类 蛋 白 酶 缺 失 的 宿 主 菌 ， 可 减 少 表 达 外 源 蛋 白 的 降 解 ‘4a。 蛋白表 OGDII 等 ‘?a利用蛋白酶缺陷型 菌 株 表 达 ?<+#?C 受 体 蛋 白 ，
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表5 巴斯德毕赤酵母表达载体的结构与功能 结构 功能 介导质粒与基因组整合和甲醇 诱导下高效表达 介导外源蛋白分泌 外源基因的整合 转录有效终止， 促进 ’89Q! 形成 遗传标记 介导整合 筛选标记 复制
源基因的阅读框架和信号肽的阅读框 架 应 该 保 持 一 致 ； 将 重 组 一般选用原生质球法或电击转化 载 体 线 性 化I然 后 转 化 酵 母 菌 ， 法， 后者较为常用， 效果也好； 最后对转化子 进 行 筛 选 ， 检测外源 蛋白是否表达； 对优良的转化子放大培养， 进行工业化生产。 外源蛋白的表达方式 目前，利用毕赤酵母表达系统 已 成 功 地 表 达 了 许 多 外 源 蛋 白。 外源蛋白在毕赤酵母中的表达分为胞内表达和分泌到胞外 % 种方式。 胞内表达如破伤风毒素蛋白的产量达 5% J K .。 胞内表达 适宜于通常在胞浆中表达或不含二硫 键 的 非 糖 基 化 蛋 白 ， 其 较 胞外分泌水平高， 但产物纯化较复杂。对于那些易于降解的不稳 定蛋白或具有毒素活性及对宿主菌有 毒 害 作 用 的 蛋 白 ， 胞 内 表 达可以将它们存储在广泛存在于甲醇 酵 母 细 胞 内 的 特 异 性 细 胞 —过氧化物酶体中。因 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 只 分 泌 很 低 水 平 分隔—— 的内源蛋白， 分泌表达的外源蛋白纯化非 常 方 便 ， 故分泌表达为 优先选择的方式。一些在其他表达系 统 中 不 能 分 泌 的 蛋 白 在 巴 在大 斯德毕赤酵母中可分泌表达， 如 人 肠 组 织 蛋 白 酶 :（ )76: ） 肠杆菌中的表达以包涵体形式存在， 在哺 乳 细 胞 中 为 胞 内 表 达 ， 而在巴斯德毕赤酵母中表达产物可分 泌 至 胞 外 。 但 基 于 蛋 白 稳 定性和折叠的需要，分泌表达方式通 常 限 于 天 然 宿 主 的 分 泌 蛋 白， 而天然非分泌蛋白往往难于分泌表达 。 同 样 ， 天然分泌蛋白 如血清白蛋白、生长激素等也难以在胞内表达为可溶性蛋白 ?5LA。 所以， 表达方式的选择受限于目的蛋白本身的特性。 外源蛋白的翻译后修饰加工 在毕赤酵母中表达的外源蛋白 一 般 要 经 过 几 个 程 序 的 加 工 才能形成有生物活性的目的蛋白。对 于 需 要 分 泌 表 达 的 蛋 白 在 此类蛋白要进行信号肽加工， 信号肽的加工 其 M 端存在信号肽， 对外源蛋白的 M 端均一化至关重要。某些含二硫键的蛋白质需 要进行二硫键的重建、 蛋白构象的正确折 叠 ， 以及适度的糖基化 修饰、 磷酸化修饰， 使所表达的外源蛋白 结 构 与 构 象 更 接 近 于 天 然蛋白。 此外，如果是糖蛋白，还要经 高 尔 基 复 合 体 对 蛋 白 糖 链 剪 避免了与酿酒酵母 切， 使 表 达 蛋 白 的 外 链 不 含 ! /5 ， */ 甘 露 糖 ， 表达系统一样的免疫原性问题。但因 毕 赤 酵 母 糖 蛋 白 与 哺 乳 动 物糖蛋白糖链结构的差异而具有的潜 在 抗 原 性 ， 使 其 在 医 药 工 业上的应用受到一定的制约，它们在 哺 乳 动 物 体 内 可 被 免 疫 系 统清除而失去效能， 而且有引起超敏反应的危险性。 外源蛋白的降解 毕赤酵母产生蛋白酶和不适宜 的 环 境 条 件 都 可 能 引 起 外 源
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巴斯德毕赤酵母（ 表达系统是目前最优秀、 D(>?(1 @1AB2C(A ） 它不但克服了大肠杆菌 应用最广泛的外源基因表达系统之一 ‘2a， 表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、 表 达 的 蛋 白 多 形 成 不 溶 性包涵体、 背景蛋白多、 表达产量低等缺陷， 弥补了哺乳类细胞、 昆虫细胞表达系统操作复杂、 表达水平低、 产业化生产造价昂贵 的不足， 还具有其他酵母表达系统无法比 拟 的 优 越 之 处 ‘8a。 该 表 达系统具有强有力的醇氧化酶（ 基因启动 M0/EF/0 /]DSMIG ， C)b2 ） 子， 可严格调控外源蛋白的表达； 同时作为真核表达系统， 可对 表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰， 从 而 使 表 达 出 的 蛋 白 具 有生物活性。此外， 该酵母菌营养要求低、 生长 快 、 培养基廉价， 易于进行操作和培养； 其高密度发酵技术业 已 成 熟 ， 便于工业化 生产； 表达量高， 许多蛋白可达到每升克级以上水平； 表达的外 源蛋白可分泌到胞外， 分泌的内源蛋白少， 外源蛋白分离纯化简 便； 外源基因通过质粒整合到基因组上， 基因工程菌株遗传稳定 性好；胞内表达蛋白的分选和区域化， 增 加 了 表 达 蛋 白 的 稳 定 性， 减少表达产物对宿主菌的毒害作用； 糖基化程度低， 与酿酒 酵母相比， 巴斯德毕赤酵母不产生过度的糖 基 化 ； 所分泌的糖蛋 白的免疫原性较低， 更利于临床应用 ‘@a。
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号 肽 主 要 有 酸 性 磷 酸 酶 ’$"5 的 信 号 肽 、 蔗 糖 酶 6G)% 的 信 号 常用 肽、 间 质 金 属 蛋 白 酶 HH’ 的 信 号 肽 及 转 化 酶 的 信 号 肽 等 ， 的是酿酒酵母的 !/HB 信号序列。另外， 如果外源基因产物不能 分泌到体外， 还可将产物连上一个定向肽 ， 使其定向运输到过氧 化物酶体中， 以免产物积累对宿主细胞造 成 毒 害 ， 同时产物稳定 不同的信号肽， 分泌效率不一样， 如用 ’$"5 、 酵 性还大大增强 ?3A。 母 H! 和天然外源基因信号肽表达小鼠 -/$7-! 受体，发现天然 信号肽的表达量比 ’$"5 信号肽要高。
2
毕赤酵母表达宿主菌
毕赤酵母是甲醇营养型酵母的一 种 ， 能 在 甲 醇 为 惟 一 碳 源
［ 收稿日期］ 899?<29<28 ［ 作者简介］王清路（ ， 男， 硕士， （ 2;3:< ） "<HMD0 ） Xh0i\EhjI/F61E/H
王清路等： 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用 达量成倍增加。 毕赤酵母中存在一种被称为微 体 的 细 胞 器 ， 其 中 大 量 合 成 过氧化物酶， 因此称为过氧化物酶体。甲醇代谢的第一步就是在 过氧化物酶体中进行的， 这样 可 以 避 免 甲 醇 在 !"# 催 化 下 产 生 合成的蛋白质贮存于微体中， 可免受蛋白 的 $%"% 对细胞的毒害。 酶的降解， 亦不会对细胞产生毒害。
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毕赤酵母表达系统表达外源蛋白的一般步骤 首先合成或克隆目的基因， 如果选 用 分 泌 型 表 达 载 体 ， 则外
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源基因的阅读框架和信号肽的阅读框 架 应 该 保 持 一 致 ； 将 重 组 一般选用原生质球法或电击转化 载 体 线 性 化I然 后 转 化 酵 母 菌 ， 法， 后者较为常用， 效果也好； 最后对转化子 进 行 筛 选 ， 检测外源 蛋白是否表达； 对优良的转化子放大培养， 进行工业化生产。 外源蛋白的表达方式 目前，利用毕赤酵母表达系统 已 成 功 地 表 达 了 许 多 外 源 蛋 白。 外源蛋白在毕赤酵母中的表达分为胞内表达和分泌到胞外 % 种方式。 胞内表达如破伤风毒素蛋白的产量达 5% J K .。 胞内表达 适宜于通常在胞浆中表达或不含二硫 键 的 非 糖 基 化 蛋 白 ， 其 较 胞外分泌水平高， 但产物纯化较复杂。对于那些易于降解的不稳 定蛋白或具有毒素活性及对宿主菌有 毒 害 作 用 的 蛋 白 ， 胞 内 表 达可以将它们存储在广泛存在于甲醇 酵 母 细 胞 内 的 特 异 性 细 胞 —过氧化物酶体中。因 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 只 分 泌 很 低 水 平 分隔—— 的内源蛋白， 分泌表达的外源蛋白纯化非 常 方 便 ， 故分泌表达为 优先选择的方式。一些在其他表达系 统 中 不 能 分 泌 的 蛋 白 在 巴 在大 斯德毕赤酵母中可分泌表达， 如 人 肠 组 织 蛋 白 酶 :（ )76: ） 肠杆菌中的表达以包涵体形式存在， 在哺 乳 细 胞 中 为 胞 内 表 达 ， 而在巴斯德毕赤酵母中表达产物可分 泌 至 胞 外 。 但 基 于 蛋 白 稳 定性和折叠的需要，分泌表达方式通 常 限 于 天 然 宿 主 的 分 泌 蛋 白， 而天然非分泌蛋白往往难于分泌表达 。 同 样 ， 天然分泌蛋白 如血清白蛋白、生长激素等也难以在胞内表达为可溶性蛋白 ?5LA。 所以， 表达方式的选择受限于目的蛋白本身的特性。 外源蛋白的翻译后修饰加工 在毕赤酵母中表达的外源蛋白 一 般 要 经 过 几 个 程 序 的 加 工 才能形成有生物活性的目的蛋白。对 于 需 要 分 泌 表 达 的 蛋 白 在 此类蛋白要进行信号肽加工， 信号肽的加工 其 M 端存在信号肽， 对外源蛋白的 M 端均一化至关重要。某些含二硫键的蛋白质需 要进行二硫键的重建、 蛋白构象的正确折 叠 ， 以及适度的糖基化 修饰、 磷酸化修饰， 使所表达的外源蛋白 结 构 与 构 象 更 接 近 于 天 然蛋白。 此外，如果是糖蛋白，还要经 高 尔 基 复 合 体 对 蛋 白 糖 链 剪 避免了与酿酒酵母 切， 使 表 达 蛋 白 的 外 链 不 含 ! /5 ， */ 甘 露 糖 ， 表达系统一样的免疫原性问题。但因 毕 赤 酵 母 糖 蛋 白 与 哺 乳 动 物糖蛋白糖链结构的差异而具有的潜 在 抗 原 性 ， 使 其 在 医 药 工 业上的应用受到一定的制约，它们在 哺 乳 动 物 体 内 可 被 免 疫 系 统清除而失去效能， 而且有引起超敏反应的危险性。 外源蛋白的降解 毕赤酵母产生蛋白酶和不适宜 的 环 境 条 件 都 可 能 引 起 外 源
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巴斯德毕赤酵母（ 表达系统是目前最优秀、 D(>?(1 @1AB2C(A ） 它不但克服了大肠杆菌 应用最广泛的外源基因表达系统之一 ‘2a， 表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、 表 达 的 蛋 白 多 形 成 不 溶 性包涵体、 背景蛋白多、 表达产量低等缺陷， 弥补了哺乳类细胞、 昆虫细胞表达系统操作复杂、 表达水平低、 产业化生产造价昂贵 的不足， 还具有其他酵母表达系统无法比 拟 的 优 越 之 处 ‘8a。 该 表 达系统具有强有力的醇氧化酶（ 基因启动 M0/EF/0 /]DSMIG ， C)b2 ） 子， 可严格调控外源蛋白的表达； 同时作为真核表达系统， 可对 表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰， 从 而 使 表 达 出 的 蛋 白 具 有生物活性。此外， 该酵母菌营养要求低、 生长 快 、 培养基廉价， 易于进行操作和培养； 其高密度发酵技术业 已 成 熟 ， 便于工业化 生产； 表达量高， 许多蛋白可达到每升克级以上水平； 表达的外 源蛋白可分泌到胞外， 分泌的内源蛋白少， 外源蛋白分离纯化简 便； 外源基因通过质粒整合到基因组上， 基因工程菌株遗传稳定 性好；胞内表达蛋白的分选和区域化， 增 加 了 表 达 蛋 白 的 稳 定 性， 减少表达产物对宿主菌的毒害作用； 糖基化程度低， 与酿酒 酵母相比， 巴斯德毕赤酵母不产生过度的糖 基 化 ； 所分泌的糖蛋 白的免疫原性较低， 更利于临床应用 ‘@a。
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号 肽 主 要 有 酸 性 磷 酸 酶 ’$"5 的 信 号 肽 、 蔗 糖 酶 6G)% 的 信 号 常用 肽、 间 质 金 属 蛋 白 酶 HH’ 的 信 号 肽 及 转 化 酶 的 信 号 肽 等 ， 的是酿酒酵母的 !/HB 信号序列。另外， 如果外源基因产物不能 分泌到体外， 还可将产物连上一个定向肽 ， 使其定向运输到过氧 化物酶体中， 以免产物积累对宿主细胞造 成 毒 害 ， 同时产物稳定 不同的信号肽， 分泌效率不一样， 如用 ’$"5 、 酵 性还大大增强 ?3A。 母 H! 和天然外源基因信号肽表达小鼠 -/$7-! 受体，发现天然 信号肽的表达量比 ’$"5 信号肽要高。
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毕赤酵母表达宿主菌
毕赤酵母是甲醇营养型酵母的一 种 ， 能 在 甲 醇 为 惟 一 碳 源
［ 收稿日期］ 899?<29<28 ［ 作者简介］王清路（ ， 男， 硕士， （ 2;3:< ） "<HMD0 ） Xh0i\EhjI/F61E/H
王清路等： 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用 达量成倍增加。 毕赤酵母中存在一种被称为微 体 的 细 胞 器 ， 其 中 大 量 合 成 过氧化物酶， 因此称为过氧化物酶体。甲醇代谢的第一步就是在 过氧化物酶体中进行的， 这样 可 以 避 免 甲 醇 在 !"# 催 化 下 产 生 合成的蛋白质贮存于微体中， 可免受蛋白 的 $%"% 对细胞的毒害。 酶的降解， 亦不会对细胞产生毒害。