超声波辅助提取检测海红果中吡虫啉农药残留的研究

超声波辅助提取检测海红果中吡虫啉农药残留的研究
作者：关正萍，王君伟，许江彬，关正
来源：《现代食品》 2018年第3期
摘要：本研究依照GB/T23379-2009，用乙腈超声提取，提取溶液经过净化，基于高效液
相色谱法（HPLC）进行快速检测。

结果表明：最理想的色谱分析条件：色谱柱温度为30 ℃，
流动相为甲醇∶水=70 ∶ 30（V/V），检测波长为270 nm，流动相流速为0.4 mL/min。

该方法定量检出最小限度为0.05 mg/kg，标准曲线相关系数为0.999 2。

因此，超声波辅助提取结合
高效液相色谱技术是一个准确、迅速、灵敏度强的检测方法，可为果蔬中吡虫啉残留的快速检
测做技术支撑。

关键词：海红果；高效液相色谱法；吡虫啉；农药残留；超声波
Abstract：The ultrasonic assisted extraction method combined with high performance liquidchromatography method was for the determination of imidacloprid residues in micromalus. This researchadopted the improved GB/T23379-2009 method, extraction with acetonitrile ultrasonic extract by amino solidphase extraction column purification, was detected. The results showed that the measurement
resultedof the optimal chromatographic conditions for HPLC, column temperature was 30 ℃ , mobile phase wasmethanol ∶ water = 70 ∶ 30, (V/V), detection wavelength was 270 nm, flow rate was 0.4 mL/min. Theminimum limit of this method is 0.05 mg/kg, the correlation coefficient of the standard curve is 0.999 2.Therefore, ultrasonic assisted extraction combined with HPLC would be an accurate, rapid, high sensitivitydetection method, and provide technical support for the detection of method of imidacloprid residue in fruitsand vegetables products.
Key words：Haihong fruit; HPLC; Imidacloprid; Pesticide residues; Ultrasonic
中图分类号：S481.8
吡虫啉是用来保护植物蔬菜防止害虫侵害的，它可以消灭多种伤害植物的虫子[1]。

近几年，吡虫啉的添加量不断增长，果蔬中的残留情况得到了人们的关注[1]，但吡虫啉在海红果中残留的检测方法还没有出现[1]。

海红果树，它是一类抗旱、抗寒、产量高的树，但在国内却是比较少有的果树种类。

它最
开始产自秦晋蒙交界处，品质优良[2]。

海红果营养价值高，海红果实具有鲜食、干制等用途，同时具有增进食欲等功能，特别对儿童以及老年缺钙的症状具有良好的食疗作用。

用其制成的食品特别受百姓青睐，具有经济开发潜力。

超声波辅助提炼结合HPLC 采取超声波帮助溶剂来提炼，这种方法可减少提炼时间，提高
提炼率[3]。

而我国还未出现明确检测海红果中吡虫啉含量的方式。

为此，本试验设计超声波辅助提取HPLC 来检测海红果中的吡虫啉的残留情况。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
主要材料：吡虫啉标准品100 μg/mL、乙腈（色谱纯）、氨基柱(500 mg/3 mL)，均购置
于沃克化学仪器单位；干制海红果，市售；哇哈哈饮用纯净水，超市购置。

主要仪器：Agilent 1260 高效液相色谱仪，菲尔伯恩实业发展（上海）有限公司；KQ-
300E 型超声波清洗器，合肥攀升超声波科技有限公司；Vortex Genie2T漩涡混合器，上海利
闻科学仪器有限公司；GTR21-1高速冷冻离心机，基因有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海汗诺仪器有限公司；HP-01 真空泵，邦西仪器科技（上海）有限公司。

1.2 试验方法
1.2.1 色谱分析条件的优化
（1）检测波长的优化。

查找国家标准GB /T23379-2009 来确定吡虫啉的紫外吸收光谱为270 nm[4]。

（2）流动相的优化。

甲醇溶液：色谱级甲醇溶液1 000 mL，用0.22 μm 的有机滤膜于抽滤装置中过滤，在功率为800 W、水温30 ℃的条件下超声处理20 min，存储备用。

超纯水：
选用哇哈哈饮用纯净水，用0.22 μm的水系滤膜于抽滤装置中过滤，在功率为800 W、水温
为30 ℃的条件下超声处理20 min，存储备用。

此次试验选择甲醇和水的比例分别为：甲醇∶水=85 ∶ 15（V/V）、甲醇∶水=80 ∶ 20
（V/V）、甲醇∶水=75 ∶ 25（V/V）、甲醇∶水=70 ∶ 30（V/V）、甲醇∶水=65 ∶ 35
（V/V）。

通过对照5 种差异色谱进样中带着被测组分前进运动的物质的配比分析图来确定最
优甲醇和水的比例[2]。

（3）流动相流速的优化。

试验选择的进样速度分别设置为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0
mL/min。

通过比较5种不同进样速度的分析图来确定最优流动相流速[2]。

（4）色谱柱温度的优化。

此次试验选择的色谱柱温度分别设置为20、25、30、35、40 ℃，通过对照5种不同色谱柱温度的色谱图来确定最优色谱柱温度[2]。

1.2.2 正交试验
以单因素试验结果为基础，以色谱柱温度（C）、进样液体速度（B）、流动相比例（A）为影响因素，以色谱图峰面积、对称因子为指标，进行正交试验。

确定最优色谱条件组合。

1.2.3 标准曲线的绘制
将标准液配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL 的标准曲线。

首先分别移取0.05、
0.1、0.2、0.5、1.0 mL，10.0 μg/mL 吡虫啉标准品于1 mL 进样瓶里面，并用甲醇溶液添加
至 1 mL，用高效液相色谱仪进行检测，将检测的峰面积对应相应的浓度绘制吡虫啉的标准曲线，求出线性回归方程[1]。

1.2.4 系统重现性的确定
选择曲线中间点浓度为2.0 μg/mL的吡虫啉样品，重复进样5 次，检查仪器系统的稳定
性[3]。

1.2.5 回收率的测定
（1）制样。

取无病虫害、无损坏的干制海红果可食部分，用纯净水浸泡6 h，粉碎并混合
均匀[5-6]。

（2）提取。

称取海红果样品4 g（精确至0.01 g）。

取10 mL 乙腈加到海红果里面，加上面配制好的溶液，让其含量依次为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/kg[2]。

同时，设置平行样与空白对照。

用超声波处理15 min以后，加入2.0 g 的氯化钠，均匀
混合10 min，固液分离10 min（5 000 r/min），然后吸5 mL 有机溶剂于新的心型瓶中，在
温度为40 ℃的旋转蒸发仪上旋干。

（3）净化。

激发净化柱用5 mL 甲醇∶二氯甲烷（5∶95），溶解残渣用2 mL甲醇∶二氯
甲烷（5∶95），反复3 回进到活化柱，接到鸡心瓶中。

洗脱用5 mL 甲醇∶二氯甲烷（5 ∶ 95），全部接收于鸡心瓶中。

40 ℃旋转蒸发仪，旋干。

加5 mL 甲醇置换，混匀，旋干[2]。

然后用1 mL 甲醇解残渣[2]。

（4）过膜。

将1 mL 溶解残渣的甲醇过0.2 μm的有机滤膜[2]。

（5）检测。

HPLC 检测[2]。

2 结果与分析
2.1 色谱条件的建立
2.1.1 检测波长的确定
借助GB/T23379-2009，发觉其最大吸收出现在270 nm 处，因此波长选择270 nm。

2.1.2 流动相配比的确定
此次试验选择的流动相分别为：甲醇∶ 水=85 ∶ 15（V/V），甲醇∶水=80 ∶ 20
（V/V），甲醇∶水=75 ∶ 25（V/V）甲醇∶水=70 ∶ 30（V/V），甲醇∶水=65 ∶ 35（V/V）。

5 种比例的流动相的检测结果分别对应图1a- 图1e。

检测条件：①检测样品，吡虫啉标准液10.0 μg/mL。

②进样液体速度，0.4 mL/min。

③
色谱柱温度30 ℃。

④检测波长，270 nm。

由图1a- 图1e 可知：当流动相为甲醇∶水=85：15（V/V）、甲醇∶水=80 ∶ 20（V/V）、甲醇∶水=75 ∶ 25（V/V）的时候，虽能检测出吡虫啉这种物质，但峰型对称度不高，并且未
出现溶剂峰。

后经检测得知当以甲醇∶水=65 ∶ 35（V/V）检测时，出峰的时间靠中，峰形对称。

当以甲醇∶水=70 ∶ 30（V/V）检测的时候，保留时间适中，峰形对称性更高，溶剂峰与
吡虫啉峰型分开，并且没有托峰，所以择优选择甲醇∶水=70 ∶ 30（V/V）作为此次试验的色
谱进样中带着被测组分前进运动的物质[7]。

2.1.3 流动相流速的确定
试验选择的进样液体的速度分别设置为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min（结果分别对应
图2a- 图2e）[8]。

不同进样速度的测量结果，如图2 所示。

检测条件：① 检测样品名称，吡虫啉标准液10.0 μg/mL。

②流动相为甲醇∶水=65 ∶ 35（V/V）。

③色谱柱度30 ℃。

④检测波长，270 nm。

由图2 可知，当色谱过程中携带待测组分向前移动的物质的速度为0.2 mL/min 的时候，
峰形对称性不好且保留时间太长；当色谱过程中携带待测组分向前移动的物质的速度为0.4
mL/min 的时候，其保留时间短，分离度较好，并且峰形对称性好，无尾峰；当色谱过程中携带待测组分向前移动的物质的速度为0.6、0.8、1.0 mL/min 的时候，保留时间虽短，但是对称
度不高。

综合考虑，选择色谱过程中携带待测组分向前移动的物质的速度为0.4 mL/min[2]。

2.1.4 色谱柱温度的确定
此次试验选择的色谱柱温度分别设置为20、25、30、35、40 ℃（结果分别对应图3a- 图
3e）。

如图3所示[9]。

检测条件：①检测波长，270 nm。

②检测样品，吡虫啉标准液10.0 μg/mL。

③ 流动相为
甲醇∶ 水=65 ∶ 35（V/V）。

④流速，0.4 mL/min。

由图3a 可知，在本试验中，柱温对保留时间、分离度等的影响并不是非常大。

综合考虑，选择柱温30 ℃ [2]。

2.2 正交实验
以单因素试验结果为基础，以柱温（C）、进样液体速度（B）、不同色谱过程中携带待测
组分向前移动的物质比例（A）为影响因素，用峰面积和对称因子当指标，进行正交试验。

正交实验的因素与水平，见表1。

选择曲线中间点浓度为2.0 μg/mL的吡虫啉样品，采用L9（33）正交试验来确定实验最
佳工艺条件，结果见表2。

正交试验极差分析阐明，3 个因素对吡虫啉色谱图的作用次序为ABC，即流动相的比例＞
流速＞柱温，最佳组合为A2B2C3，即当流动相比例为甲醇∶水=70 ∶ 30（V/V），流动相的流
速为0.4 mL/min，柱温35 ℃时，峰面积最接近测量值。

但由正交表选择的最理想组合与色谱
条件优化的理想组合A2B2C2 不相同，所以对以上两个组合再进行验证实验。

2.2.2 最优配方选择验证实验
由于正交表中的最优组合与色谱条件优化最优组合有差异，故需进行验证实验来保证实验
结果的准确性。

选择曲线中间点浓度为2.0 μg/mL 的样品，分别以A2B2C2 与A2B2C3 这两组
色谱条件组合进行验证，峰面积最接近被测值的为此次最优组合。

验证实验结果，见表3。

表3 表明：用A2B2C2 这一组合的峰面积最接近测量值，所以此次实践的最优组合为
A2B2C2。

当流动相比例为甲醇∶水=70 ∶ 30（V/V），流速为0.4 mL/min，色谱柱温度30 ℃时，峰面积最接近测量值，对称性高。

2.3 标准曲线和检出限
将标准液配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL 标准曲线样液，求出标准曲线的回归
方程为y=75.754x+9.170 6及相关系数是0.999 2[10-11]。

结果如图4 所示。

分析图4 可知，本方法定量限为0.05 mg/kg，完全符合国内外规定残留最高值（MRL）[1]。

2.4 系统的重现性
选择曲线中间点浓度为2.0 μg/mL的吡虫啉样品，重复进样5 次，检查仪器系统的稳定
性[12-13]。

检测结果，见表4。

由表4 可知，吡虫啉峰面积依次为163.4、160.7、165、
164.5、167.2，平均峰面积164.16，说明系统重复性较好。

2.5 海红果中吡虫啉的回收率
使各样品中吡虫啉的含量分别为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/kg[14-15]。

同时设
置3 组平行样与空白对照[2]。

结果见表5。

当海红果中吡虫啉的添加量分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/kg 时，平均回收率分
别为86.76%、87.65%、92.75%、86.45%、93.65%，变异系数为1.23% ～ 2.4%。

结果表明，相对标准偏差＜ 5，在允许范围内[10]，达到农药残留分析的条件[16-17]。

3 结论
此试验为快速检测海红果吡虫啉的农药残留研究。

首先进行色谱条件的优化，色谱柱温度
30 ℃；流动相配比为甲醇∶水=70 ∶ 30（V/V），检测波长270 nm，流动相流速0.4 mL/min。

然后进行标准曲线的绘制以及系统重现性和回收率的测定。

结果表明：当添加水平在0.25 ～
4.0 mg/kg 时，回收率均在80% ～ 120%，相对标准偏差＜ 5；该方法的定量出现的最小值为
0.05 mg/kg，标准曲线线性关系数0.999 2。

因此，本试验检测更准确、讯速、灵敏，可作为果蔬中吡虫啉检测的技术支持。

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作者简介：关正萍（1975—），女，博士，副教授；专业方向为农产品安全检测及溯源技
术研究、食品科学与工程、食品质量安全与控制等。