伊维菌素微乳中伊维菌素的含量测定方法研究

伊维菌素微乳中伊维菌素的含量测定方法研究
王嗣涵;张继瑜;邢守叶;李冰;周绪正
【摘要】为建立伊维菌素微乳中伊维菌素含量的高效液相色谱(HPLC)测定方法,选用Hypersil ODS2 (5 μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱,流动相为甲醇∶乙腈∶水为35∶60∶5(V/V/V),检测波长为244 nm,柱温为30 ℃,流速为1 mL/min进行测定.结果显示,伊维菌素在该色谱条件下,系统适应性良好,在80~320 μg/mL浓度范围内线性关系良好,回归方程为:Y=22 700X+2 510,R2=0.9998,总平均回收率为101.90%±2.94%,RSD为2.88%,对中试生产的3批伊维菌素微乳进行含量测定,RSD为1.86%.表明该含量测定方法准确可靠,重现性好,可用于伊维菌素微乳中伊维菌素含量的测定,并为该新型制剂的质量标准的制定和质量评价提供依据,也为后期的临床安全应用提供可靠的参考.%In order to establish the determination method of ivermectin (IVM) in the ivermectin microemulsion injection by high performance liquid chromatography (HPLC), Hypersil ODS2 colunm (5 μm,4.6 mm×250 mm) was used in this study.The mobile phase composed of methanol, acetonitrile and water (35∶60∶5,V/V/V) at a flow rate of 1 mL/min.The detection wave length was set at 244 nm and the column temperature was 30 ℃.The results showed that the HPLC system suitability of IVM was good.A good linear correlation of IVM was observed within the concentration range 80 to 320 μg/mL, and the average recovery rate was 101.90%±2.94% with RSD was 2.88%, the regression equation was Y=22 700X+2 510 (R2=0.9998).The RSD of IVM content in ivermectin microemulsion injection was 1.86%.The method was accurate and reliable,reproducible,easy to operate, which could be used in new type of
ivermectin microemulsion injection.The method could be used as the basis of quality control and establishing a quality standard, and to provide basis for quality evaluation, also can provide reliable reference for safe veterinary clinical application in the future.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2017(044)006
【总页数】8页(P1861-1868)
【关键词】伊维菌素微乳;伊维菌素;高效液相色谱法
【作者】王嗣涵;张继瑜;邢守叶;李冰;周绪正
【作者单位】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实
验室,兰州 730050;甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,兰州 730050;甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,兰州 730050
【正文语种】中文
【中图分类】S859.1
伊维菌素(ivermectin, IVM)为新型大环内酯类抗生素类驱虫药，具有高效、广谱、低毒等优点，是美国Merck公司处理得到的第一个阿维菌素 (avermectin, AVM )类药物衍生物[1]。

伊维菌素可用于马、牛、绵羊、猪、犬、禽等多种动物驱杀线
虫等寄生虫，驱杀效果达到94%～100%[2]，对马胃蝇和羊鼻蝇各期幼虫及牛羊
的疥螨、痒螨、毛虱、血虱、腭虱及猪疥、螨猪血虱等外寄生虫也具有良好的杀灭作用，是畜牧生产中应用最广泛和使用量最大的一种理想的抗体内、外寄生虫药物[3]。

现已开发出多种可供兽医临床使用的剂型，如片剂、注射剂等。

伊维菌素的传统制剂能有效地驱杀动物体内线虫和体外节肢动物，由于生产工艺较简单，生产成本相对较低，一度满足了畜牧业生产的需要。

但大多数伊维菌素传统制剂其药物的释放均按一级动力学进行，血液中药物浓度起伏变化大，常出现“峰谷”现象，其血药浓度均有可能超出最低中毒浓度，且有效血药浓度维持时间短，往往需要多次重复给药才能达到有效治疗目的，增加了劳动成本。

有的剂型重复给药对动物的刺激较大，应激反应明显，不利于动物的健康生长。

畜牧业的发展客观上要求研制开发出优良的长效制剂[4]。

伊维菌素缓释控释制剂的共同特点是其接
近零级动力学释药，可长时间将血药浓度保持在有效浓度范围内而不出现毒副作用，因而可减少给药次数，有的能减少到一年一次或更长的时间，且能有效地达到长期预防和治疗的目的。

这种剂型符合了当前畜牧业发展的需要，但目前伊维菌素缓释控释制剂研究较多的包括伊维菌素缓释巨丸剂、伊维菌素聚乳酸微球制剂、透皮吸收剂、长效注射剂等[5-6]。

国内对缓释控释制剂的研究起步较晚，目前上市的产
品不多。

农业部兽用药物创制重点实验室成功研制出伊维菌素微乳新型制剂，以水包油型(O/W)来达到伊维菌素增溶的目的[7-8]。

微乳(microemulsion，ME)作为
一种新型药物载体，对水溶性、脂溶性及难溶性药物均有良好的溶解能力，且具有缓释和靶向作用[9-10]。

测定伊维菌素含量是伊维菌素微乳制剂质量控制的关键，可为该制剂的质量标准的制定和质量评价提供依据，并为其安全可靠地应用于兽医临床提供保障。

本研究应用HPLC-UV测定该制剂中伊维菌素的含量，依据《中华人民共和国兽药典(一部)》(2010版)[11]和《兽药研究技术指导原则汇编(2006-2011年)》[12]中质量控制分析方法验证指导原则，对伊维菌素的含量测定方法进
行了优化，以期建立准确可靠、重现性好、简便、快速的伊维菌素含量测定方法，为该制剂的进一步深入研究提供参考。

1.1 材料
伊维菌素标准品(含量92%)购自中国食品药品检定研究院；伊维菌素微乳(批次：20140919、20140921、20140922)、不含伊维菌素的空白溶剂(批次：20140923)、80%、100%、120%的伊维菌素微乳制剂(批次：20140923、20140924、20140925)均购自中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所；甲醇、乙腈(色谱纯)购自Fisher Scientific公司。

Waters 2695高效液相色谱仪、Waters2489紫外可见光检测器、Empower2色谱工作站均购自Waters公司；C18色谱柱Hypersil ODS2填料(5 μm，4.6 mm×250 mm)购自大连依利特公司；Sartorius ME235S电子天平购自北京赛多利斯天平有限公司；KQ-300DE超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；溶剂过滤器购自Phenomen公司。

1.2 方法
1.2.1 伊维菌素检测波长的确定精密称取2.00 mg伊维菌素标准品置于100 mL 容量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，混匀，配制成0.02 mg/mL的伊维菌素甲醇溶液。

以甲醇为空白对照，在200～400 nm的波长范围内对伊维菌素的甲醇溶液进行紫外扫描。

1.2.2 色谱条件色谱柱：C18柱，Hy persil ODS2 (5 μm,4.6 mm × 250 mm)；柱温30 ℃，进样量10 μL，检测波长244 nm；流动相：甲醇∶乙腈∶水
=35∶60∶5(V/V/V)；流速为1 mL/min。

1.2.3 供试品溶液的配制取伊维菌素微乳，精密吸取1 mL于50 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度、摇匀。

进样前经0.22 μm滤膜滤过，滤液进样量为10 μL。

1.2.4 系统适应性精密称取伊维菌素标准品(含量92%) 0.02174 g于100 mL容
量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度、摇匀，作为系统适用性试验溶液，进样前用0.22 μm的有机滤膜过滤，进样量为10 μL，记录色谱图。

分析伊维菌素H2B1b 与H2B1a峰的分离度及H2B1a的理论塔板数。

1.2.5 杂质干扰试验按照1.2.2中方法分别配制伊维菌素微乳样品溶液，和不含伊维菌素的空白微乳样品溶液，10 μL进样，分析不含伊维菌素的空白微乳对伊维菌素峰是否有干扰。

1.2.6 标准品溶液的制备精密称取伊维菌素标准品(含量92%) 0.02717 g于25 mL容量瓶中，甲醇溶解、定容至刻度、摇匀，即为储备液；分别精密吸取储备液0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8和3.2 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度、摇匀，其浓度分别为80、120、160、200、240、280和320 μg/mL。

1.2.7 线性关系考察在上述色谱条件下分别测定伊维菌素标准品各浓度梯度溶液的峰面积，每个样品测定3次，以平均峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归。

1.2.8 精密度试验将标准曲线的浓度为320、200、80 μg/mL的3个样品，在同日内不同时间进样5次，求得日内精密度。

将该3个样品连续进样5 d，每天同一时间测定，求得日间精密度。

1.2.9 回收率试验制备伊维菌素微乳浓度80%、100%、120%的伊维菌素微乳溶液，每个浓度制备3份供试品，测定样品中伊维菌素的含量，并与真实值比较，计算回收率和相对标准偏差。

进样前，经0.22 μm滤膜滤过，滤液进样量为10 μL。

1.2.10 样品测定将各批次的伊维菌素微乳制剂按照上述的色谱条件及方法进行测定，每个批次平行测定3次。

2.1 伊维菌素检测波长的确定
伊维菌素甲醇溶液的紫外扫描图谱见图1。

由图1可知，伊维菌素在200～800 nm的波长范围内的最大吸收波长在244 nm处，因此确定244 nm作为HPLC
的检测波长。

2.2 系统适应性
由图2可知，将配制好的伊维菌素标准品溶液进样10 μL，伊维菌素H2B1b的保留时间为6.2 min，H2B1a的保留时间为7.0 min，H2B1b与H2B1a的分离度
为3.31，H2B1a的理论塔板数为42 595，符合《中国兽药典》中“伊维菌素
H2B1b与H2B1a的分离度应不小于3.0，理论塔板数按H2B1a峰计算应不低于
2 000”的要求。

2.3 杂质干扰试验
由图3可知，伊维菌素在保留时间范围内，不含伊维菌素的空白微乳对伊维菌素
的HPLC测定无干扰。

2.4 标准品及原料药的色谱图
由图4可知，在前述的色谱条件下，伊维菌素微乳在伊维菌素标准溶液的色谱条
件下检测器响应灵敏，色谱出峰状况良好，且注射剂中的纳米微乳辅料对伊维菌素原料药的色谱图出峰无影响，伊维菌素标准溶液的色谱条件适用于伊维菌素微乳的含量测定。

2.5 标准曲线绘制
各浓度梯度标准品溶液的平均峰面积见表1。

以伊维菌素各浓度梯度标准品溶液的平均峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行线性回归，得到伊维菌素的标准曲线，伊维菌素标准品溶液在80～320 μg/mL的浓度范围内，选取7个浓度分别为80、120、160、200、240、280和320 μg/mL的伊维菌素标准溶液与其所对应的色谱峰面积之间的线性关系良好，回归方程为：Y=22 700X+2 510，R2=0.9998(图5)。

2.6 精密度试验结果
选取伊维菌素标准品溶液浓度为320、200、80 μg/mL的3个样品，在同日内不同时间进样5次，求得日内精密度，该3个浓度样品连续进样5 d，每天同一时间
测定，求得的日间精密度，结果见表2、3。

由表2、3可知，伊维菌素日内精密
度和日间精密度均小于10%，符合《兽药研究技术指导原则汇编(2006-2011)》
中方法验证对精密度的要求。

2.7 回收率
由表4可知，浓度为80%、100%、120%的伊维菌素微乳制剂中，伊维菌素的回收率为97%～105%，总平均回收率为101.90%，RSD为2.88%，说明该含量测定方法准确度高，且符合回收率在80%～120%之间的要求。

2.8 含量测定结果
对中试生产的3批伊维菌素微乳制剂产品进行含量测定，结果见表5。

由表5可知，伊维菌素的平均含量在95%～100%之间，RSD为1.86%，符合《兽药研究
技术指导原则汇编(2006-2011年)》中方法验证对含量测定的要求。

限于新型制剂的开发与新型检测技术的应用及技术普及等问题，临床上使用的伊维菌素多为口服片剂，受当时检测技术的限制，制剂的含量多采用紫外分光光度法测定，周洋等[13]、刘群等[14-15]采用紫外分光光度计，通过对比待测药品溶液与
标准品溶液的吸光值，按相对标示量=实测浓度/标示浓度，计算出相对标示浓度。

该方法设备简单，操作简便，但灵敏度及精确定量不如高效液相色谱高。

本试验与金录胜[16]、任丽君[17]、肖国君等[18] HPLC测定法相似，本试验伊维菌素含量测定的剂型与之前报道的剂型不同，辅料采用纳米微乳，在使用HPLC法测定含
量时通过优化系统适应性试验及筛选最适流动相比例，得出色谱图中空白微乳的峰形响应低，峰形平缓，避免了含量测定时辅料对新型伊维菌素微乳注射剂中伊维菌素出峰的干扰。

本研究测定伊维菌素的色谱条件是按照《中华人民共和国兽药典(一部)》(2010版)中规定的甲醇∶乙腈∶水(体积比为35∶53∶12)进行优化，此时伊维菌素H2B1b
与H2B1a两个色谱峰峰形较宽，且理论板数不如优化后的甲醇∶乙腈∶水(体积比
为35∶60∶5)高。

液相色谱优化条件后的伊维菌素色谱图较好，理论塔板数高，
伊维菌素H2B1b与H2B1a的分离度好，大于3.0，可用于伊维菌素的含量测定。

对伊维菌素标准品溶液进行紫外扫描，伊维菌素甲醇溶液在244 nm处有最大吸收。

在《中华人民共和国兽药典(一部)》(2010年版)中伊维菌素的项下检测波长为254 nm，通过多次试验测定，发现此波长下伊维菌素标准品溶液的吸收比244 nm处的紫外光谱吸收弱，考虑到流动相的末端吸收，故选用244 nm作为本次含量测定的检测波长。

伊维菌素作为一种高效广谱抗寄生虫药，在兽医临床领域多用于马、牛、羊等大型家畜消化道线虫和肺线虫疾病的防制。

在人医临床使用时伊维菌素常用来处理螨虫、蜱虫等寄生虫。

近年来研究表明，蚊子在叮咬了使用过伊维菌素的人后会产生中毒效应，即使蚊子没有被杀死，它体内携带的疟原虫也会被杀死。

Alout等[19]在进行了一场小规模临床试验后，第一次测量了伊维菌素对疟疾的效果。

他们发现，在额外使用伊维菌素的试验组里，5岁以下儿童疟疾发病率下降了16%。

Sampaio
等[20]随即也在泰国做了一项试验，这项试验第一次测试了伊维菌素对间日疟原虫的作用，结果发现将感染疟疾的人的血液与这种药混合喂给蚊子，杀死了25%的
蚊子，并清除了45%的活着的蚊子体内的疟原虫，在仍感染疟原虫蚊子体内，疟
原虫数量下降了50%。

临床使用时伊维菌素的药代动力学过程受许多因素的影响，其制剂配方、给药途径、种间差异、饲喂方式和饲喂量都能显著影响伊维菌素的药代动力学参数[21]。

因此，针对不同条件下的不同动物，设计一个完善的给药程序，选用合理的剂型用于临床治疗，是今后推广新型伊维菌素微乳注射剂普及的重要工作之一。

本研究在抗寄生虫药物研发过程中，对防制动物寄生虫病，提高生产性能及畜牧业生产经济效益具有重要意义。

本试验中伊维菌素的含量测定方法符合要求，方法可靠、选择性好、重现性好、操
作简便，可用于伊维菌素纳米微乳中伊维菌素的含量测定，为今后纳米微乳注射液的质量评价和质量标准的制定奠定了基础，并为其进一步研究和开发提供了依据。

*通信作者：周绪正(1971-)，男，甘肃人，副研究员，硕士生导师，研究方向：兽医药理与毒理学，E-mail：*****************
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