流感病毒的分离鉴定(二)

流感病毒血凝试验
试管号 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃0.2 病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对 照 0.5%鸡红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 摇匀置室温60～90分钟 结果
实验材料
(1)接种流感病毒的鸡胚。 (2)质量分数为0．5％的鸡红细胞悬液。
(3)流感病毒型与亚型免疫血清。
(4)碘酒，酒精消毒棉球。 (5)灭菌的镊子、剪刀。 (6)无菌小试管，毛细滴管，吸管。 (7)生理盐水。
(8)试管、试管架。
实验方法：
1、血细胞凝集实验 (1)收获尿囊液：鸡胚孵育3d后,放4度冰箱过夜,次日 取出鸡胚,消毒气室端卵壳,用小镊子在无大血管处 撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管
实验十 流感病毒的分离鉴定（二）
1、血细胞凝集实验 2、血细胞凝集抑制试验
目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。 原理：流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠 等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待 检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象， 即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝 抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免 疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用， 借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。
++++ ++++ ++++ +++ ++ ++ + － － －
→
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㈠
㈡
㈢
㈣
㈤
㈥
㈦
㈧
㈨
㈩
试管号 10
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67Biblioteka 89生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃0.2 病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对照 0.5%鸡红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 摇匀置室温60～90分钟 结果
“+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
凝，在管底中心形成小红点。
“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不
凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。
“+”：只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小
圆点，凝集的红细胞在小圆点的周围。
“—”：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。
结果观察 先观察3支对照管，如抗原对照管出现完全凝集，血清对照和红 细胞对照不发生凝集，再观察试验管。 血凝抑制效价：完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度，即该 血清的抑制效价。 鉴定病毒时，效价应与原免疫血清效价相等或相似，血凝抑制 试验亦可用已知病毒抗原，测定病人血清抗体以进行血清学诊 断，恢复期比初期抗体效价增高4倍以上才有诊断意义。
凝集效价：能使红细胞呈“++”凝集的病毒最高稀释
度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。 如表，第6个试管为“++”，且病毒稀释度最高，则该病
毒悬液效价为1:640，即该病毒悬液稀释到1：640时，每
0．2mL中含有一个血凝单位，配制4个血凝单位的病毒悬 液时，病毒液应稀释成(1：640)X4，即1：160。
2、血细胞凝集抑制试验
按表加入材料和试剂
试 管 生理盐水 1：5血清 4u病毒液 0.5％鸡红 细胞 1 待测 － 0.2 0.2 0.2 2 待测 － 0.2 0.2 0.2 3 血清对照 0.2 0.2 － 0.2 4 抗原对照 0.2 － 0.2 0.2 5 红细胞对照 0.4 － － 0.2
++++ ++++ ++++ +++ ++ ++ + － － －
(6)结果观察 观察时要轻拿、勿摇，首先观察对照管应无凝集，然 后再观察试验管，各管出现的凝集程度以“++++”、 “+++”、“++”、“+”、“—”表示，判断标准如下： “++++”：全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底， 边缘不整齐。
中。
(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。
(3)取10支小试管，按给各管加入生理盐水0.2mL。 (4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管 中，混匀后，再吸出0．2mL加入第2个试管中； 混匀后，从第2个试管吸出0．2mL加入第3个试 管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均 为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理 盐水对照管。 (5)稀释完毕后加人体积分数为0．5％的压积鸡红 细胞悬液，每管0．2mL,室温放置30~60mn。