Solexa测序原理及实验流程

Solexa测序原理及实验流程
(2011-04-19 09:45:04)
Solexa 高通量测序原理
Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ，此种测序法首先是
将 DNA 从细胞中提取，然后将其打断到约 100 － 200bp 大小，再将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。

随后在含有接头的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段绑定在 flow cell 上，经反应，将不同片段扩增。

在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。

互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。

多余的核苷被移走。

这样每个单
链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。

针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。

荧光信号被 CCD 采集， CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。

通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。

Solexa 的这种方法，可在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS － sequencing by synthesis），可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。

并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断 , 因此在同一个芯片或几个芯片上花费很少（只需常规方法的 1 ％）的成本就可测试全基因组。

实验流程
1. 文库制备
将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。

2. 产生DNA簇
利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。

另外一端（5’或3’）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“桥 (bridge) “。

反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。

DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。

3. 测序
Genome Analyzer系统应用了边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理。

加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。

这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。

此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。

之后，将这些基团化学切割，恢复3’端粘性，继续聚合第二个核苷酸。

如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。

这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。

目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。

读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。

4. 数据分析
自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析。

Solexa测序技术属于新一代测序技术（第二代），其的核心思想感是边合成边测序（sequencing by synthesis or ligation, SBS&SbL）。

即生成新DNA 互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应崔化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。

通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。

Solexa公司在2006年被Illumina公司以6.15亿美元的高价收购，并将Solexa测序仪命名为Illumina genome analyzer。

其测序原理民是“边合成边测序”，同时可以在DNA扩增表面读取数千万个32-40bp长的片段。

Solexa测序具体流程下图所示：
1.添加接头。

利用物理方法将待测样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端加上接头(1)。

2.表面结合。

Solexa的测序时利用微注射系统将已经加过接头和待测片断随机添加到玻璃Flow Cell内，每一个Flow Cell又补分成8条Lane(FIGURE1)，每条Lane的内表面上能与共价键的形式随机固定单链接头序列和带接头的单链待测DNA片断(2)。

3.桥型扩增循环获得多拷贝待测DNA片断。

在Flow cell内加入未被标记的dNTP和酶起始固相桥型扩增(3)。

所有单链桥型待测片段被扩增成双链桥片断，通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面(4,5)。

通过不断循环，将会在Flow cell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片断(6)。

4.测序。

加入DNA聚合酶和被荧光标记的dNTP 和接头引物进行扩增，在每一个测序列簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从获得待测片段的序列信息(7,8,9,10,11,12)。