维真生物-IPTG诱导蛋白表达的实验方法

IPTG诱导蛋白表达的实验方法
实验原理：
E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。

I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O
序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。

在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。

由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。

在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。

此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA 聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。

当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。

在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。

乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

实验试剂：
1、LB（Luria-Bertani）培养基：酵母膏(Yeast extract)5g 、蛋白胨(Peptone) 10g 、NaCl 10g 、琼脂(Agar) 1-2% 、蒸馏水(Distilled water) 1000ml 、pH 7.0。

2、IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，-20 ℃保存。

3、凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 、50 mmol / L DTT、2 % SDS （电泳级）、0.1 ％溴酚蓝、10 ％甘油。

实验步骤：
1、用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因；
2、按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中；
3、分别挑取单菌落接种于5 mL LB ( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中，37℃培养过夜；
4、以2 %体积比转接于2 ml LB( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5 hr，至细菌对数生长期，加0.1 mmol/L IPTG 2 µl诱导3-4 hr，同时设立不加IPTG诱导作为对照；
5、取上述菌液1 mL，12000 rpm离心10min，收菌沉淀；
6、重悬于冰的100 µl PBS中，加入PMSF至终浓度为10 mmol/L。

震荡器震荡混匀，加入2×加样缓冲液，煮沸10 min变性，12,000 rpm 离心10 min；
7、分别取诱导前和诱导后的样品10 µl进行SDS-PAGE电泳分析。

（PS：如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6，迅速使温度升至42 ℃继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L，继续培养3 -5h）
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